馬梓承 李 焱 曹 龍 焦秋林 劉照虎 王宏宇 孟凡亮 劉思當(dāng),2,3*

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000；2山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；3山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東泰安 271018）

目前豬圓環(huán)病毒共有3個(gè)血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV2為豬群主要致病性病毒，也是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）和皮炎與腎病綜合征（PNDS）的主要病原。主要引起豬只皮膚蒼白，被毛蓬亂，呼吸困難，體表淺淋巴結(jié)特別是腹股溝淺淋巴結(jié)腫大，豬群漸進(jìn)性消瘦或生長(zhǎng)遲緩。且所引起的免疫抑制更是困擾豬場(chǎng)的一大亟待解決的難題[1-3]。

副豬嗜血桿菌病目前是嚴(yán)重危害中國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的重要細(xì)菌病之一。最近幾年，由于中國(guó)人口眾多，對(duì)豬肉食品的高度需要，加上養(yǎng)殖戶為了謀求更大的利益，導(dǎo)致保育圈舍的飼養(yǎng)密度越來越大，豬群越來越不安全，副豬嗜血桿菌感染在保育仔豬階段呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢(shì)[4]。當(dāng)豬群感染病毒性疾病后，機(jī)體抵抗力下降，此時(shí)包括副豬嗜血桿菌在內(nèi)的細(xì)菌病便會(huì)“乘虛而入”，使得機(jī)體在患病毒病的同時(shí)繼發(fā)感染細(xì)菌病，加重了動(dòng)物病情，引起動(dòng)物最終死亡。據(jù)臨床病料信息統(tǒng)計(jì)，藍(lán)耳病病毒和圓環(huán)病毒與副豬嗜血桿菌混合感染的比例最高。但是隨著豬只日齡的逐漸增長(zhǎng)，抗生素對(duì)于副豬嗜血桿菌的療效越來越弱，所以早期針對(duì)病毒性疾病的完善的免疫流程和合理的藥物防治顯得尤為重要[5]。為研究和探尋副豬嗜血桿菌病的正確防治流程，現(xiàn)介紹1例山東泰安地區(qū)某規(guī)?；i場(chǎng)副豬嗜血桿菌病典型病例的診斷與防治。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病背景

山東泰安某豬場(chǎng)現(xiàn)有存欄母豬50頭、保育豬280頭。2018年6月該豬場(chǎng)40余頭50日齡左右的保育豬出現(xiàn)高熱（39.5～41.5℃），精神沉郁，部分病豬體表被毛粗亂；采食量顯著下降，伴有明顯的呼吸困難綜合征。對(duì)病豬注射青霉素，使用包被的恩諾沙星拌料，但效果不理想；發(fā)病豬死亡周期較長(zhǎng)，一般在7～10 d；隨著疫情逐步擴(kuò)大，1周后保育舍發(fā)病率高達(dá)60%，死亡率達(dá)40%，遂前來就診。該豬場(chǎng)免疫程序?yàn)椋鹤胸i2日齡滴鼻偽狂犬病疫苗，20日齡免疫豬藍(lán)耳病疫苗，28日齡免疫豬瘟疫苗。另了解豬群日常保健不良，病豬曾用恩諾沙星，然而死亡率并未下降。

1.2 主要儀器及試劑

TaqDNA聚合酶，DNA Marker DL 2 000，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；TSA培養(yǎng)基，TSB培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD公司；DNA/RNA Kit，Easy Script One-Step RT-PCR Super Mix，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 送診病豬臨床癥狀

病豬精神萎靡，不愿走動(dòng)；呼吸急促，頻率快，伴有間歇性咳嗽癥狀；腹股溝淋巴結(jié)腫大異常；高熱，體溫在41℃左右；呼吸困難，黏膜發(fā)紺，體態(tài)虛弱。

1.4 剖檢變化和樣品采集

對(duì)送檢病豬采取頸動(dòng)脈放血致死，剖檢發(fā)現(xiàn)病死豬胸腔、腹腔、肺臟、心臟、肝臟、脾臟等器官表面有大量纖維素性滲出物，并造成不同程度的黏連；心包積液、心臟外側(cè)充滿纖維素性滲出物；肺臟間葉、心葉嚴(yán)重實(shí)變，手觸如橡皮一般，內(nèi)部氣體充盈，切面濕潤(rùn)，有漿液滲出，呈典型“橡皮肺”；全身淋巴結(jié)腫大，腹股溝淋巴結(jié)腫大，最為突出；肝臟質(zhì)硬易碎，色澤暗淡，無(wú)血色，布滿白斑；脾臟表面布滿丘陵?duì)畛鲅睿浑p腎均見明顯的白色斑點(diǎn)狀壞死灶（圖1）。

1.5 病料處理

各取少量?jī)龃娴钠⑴K、淋巴結(jié)、腎臟、肝臟等組織，放入研磨器中，加入1 mL滅菌PBS，將研磨后產(chǎn)物轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中。在－80℃冰箱中反復(fù)凍溶3次后，12 000 r/min離心7 min，將上清吸入1.5 mL滅菌離心管中，備用。使用北京全式金EasyPure ViralDNA/RNA kit（批號(hào)：L41228）提取病毒核酸，整個(gè)操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

圖1 病豬脾臟、腹腔、胸腔、肺臟、肝臟、腎臟等器官病變圖

1.6 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI上已發(fā)表的豬瘟病毒（CSFV）、藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、偽狂犬病病毒（PRV）、PCV2經(jīng)典毒株的保守基因序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

表1PCR/RT-PCRR引物序列

2 結(jié)果

2.1 病毒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

通過PCR/RT-PCR方法擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，根據(jù)紫外凝膠成像儀下具體條帶位置判定病豬的病原感染狀況（圖2），可知病豬僅感染PCV2，未檢出其他病毒。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 細(xì)菌分離鑒定

取新鮮肺臟，劃線接種于含有10%新生犢牛血清和20 g/mL NAD的TSA培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24～48 h后挑取疑似菌落進(jìn)行傳代純化，純化培養(yǎng)后24～48 h可見針尖大小的無(wú)色透明且光滑濕潤(rùn)的菌落。革蘭氏染色后顯微鏡鏡檢可見，呈革蘭氏陰性桿菌，具有多種形態(tài)，從短桿狀、細(xì)長(zhǎng)桿狀到長(zhǎng)絲狀不等，其中大多數(shù)細(xì)菌呈略微彎曲的桿狀（圖3）。

圖3 革蘭氏染色鏡檢

2.3 生化鑒定

將分離純化得到的疑似菌落分別接種于木糖、觸酶、氧化酶、吲哚、硝酸鹽、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露醇、脲酶微量生化鑒定管中，每支生化管中加入1 μL犢牛血清和1 μL NAD的（V因子），于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。其中甘露醇、木糖、脲酶、氧化酶、H2S、吲哚反應(yīng)呈陰性，蔗糖、葡萄糖、果糖、觸酶、半乳糖、硝酸鹽反應(yīng)呈陽(yáng)性（表2），符合副豬嗜血桿菌生化特性。

表2 生化特性培養(yǎng)結(jié)果

2.4 細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果

取提純后細(xì)菌菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，可見在821 bp的位置出現(xiàn)了與副豬嗜血桿菌陽(yáng)性對(duì)照相同的條帶（圖 4）。

圖4 瓊脂糖凝膠電泳圖 （副豬嗜血桿菌）

2.5 病理組織學(xué)診斷

病理組織學(xué)變化見圖5，脾臟可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞壞死，視野中充滿大量紅細(xì)胞（圖5A）；腎臟間質(zhì)出血，炎性細(xì)胞增生，呈間質(zhì)性腎炎病變（圖5B）；腹股溝淋巴結(jié)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，充滿大量嗜中性粒細(xì)胞，且伴有大量紅細(xì)胞（圖5C）；心外膜纖維化，心肌炎性細(xì)胞增生，間質(zhì)充血出血，呈間質(zhì)性心肌炎病變（圖5D）；肝臟鏡下可見巨噬細(xì)胞增生，嗜中性粒細(xì)胞增生（圖5E）；肺臟可見細(xì)支氣管充滿炎性細(xì)胞，以嗜中性粒細(xì)胞居多，化膿性支氣管炎，間質(zhì)性肺炎；肺泡腔內(nèi)漿液性滲出，肺泡間質(zhì)輕微充血、出血（圖5F）。

3 討論與防治

根據(jù)臨床病例剖檢、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及組織病理學(xué)觀察結(jié)果分析，該場(chǎng)大規(guī)模豬群死亡是因感染PCV2導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，后繼發(fā)副豬嗜血桿菌病。確診后，及時(shí)調(diào)整豬場(chǎng)的免疫程序，對(duì)未發(fā)病豬群緊急補(bǔ)免PCV2疫苗。采用氟苯尼考和黃芪多糖拌料防治，對(duì)于發(fā)病嚴(yán)重豬，單獨(dú)注射恩諾沙星針劑，連用1周，及時(shí)控制了該場(chǎng)的疫情蔓延，減少了經(jīng)濟(jì)損失。

研究發(fā)現(xiàn)各地分離到的副豬嗜血桿菌的血清型復(fù)雜多樣，根據(jù)Kieletein-Rapp-Gabriedson瓊脂擴(kuò)散血清分型方法，至少可將副豬嗜血桿菌分為15個(gè)血清型，另有20%以上的分離株不能定型，各型之間交叉保護(hù)力弱[6]。當(dāng)發(fā)生副豬嗜血桿菌感染時(shí)，應(yīng)及時(shí)到相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行細(xì)菌分離及血清分型鑒定，通過流行病學(xué)調(diào)查的方法及時(shí)明確豬場(chǎng)流行的主要血清型，以便選用合適的疫苗進(jìn)行補(bǔ)免，對(duì)病情較重的豬場(chǎng)應(yīng)結(jié)合抗生素進(jìn)行防治。然而隨著抗生素的大量使用，副豬嗜血桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥性越來越高，采用輪轉(zhuǎn)用藥、交替用藥可以顯著降低副豬嗜血桿菌的耐藥性。而不同地區(qū)的副豬嗜血桿菌對(duì)藥物敏感性各不相同，因此藥敏試驗(yàn)是篩查敏感藥物的一項(xiàng)重要舉措。

由于PCV2致死率較低，為節(jié)省治療成本，大多數(shù)養(yǎng)豬場(chǎng)總是抱著無(wú)所謂的態(tài)度，選擇不免疫PCV2疫苗，將資金著重用于豬瘟、偽狂犬病、藍(lán)耳病等高致死性病毒病的免疫。這可能造成PCV2在場(chǎng)內(nèi)瘋狂傳播。如果單是感染圓環(huán)病毒病，成年豬尚可以耐過，但患病期間，整個(gè)豬群免疫力急劇下降，非常容易混合或繼發(fā)感染病毒病及其他細(xì)菌病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失；而且PCV2具有免疫抑制性，當(dāng)機(jī)體內(nèi)存在此病原時(shí)，免疫抗體水平有可能根本無(wú)法達(dá)到理想的保護(hù)水平，給豬場(chǎng)帶來極大的安全隱患[7]。

圖5 組織病理學(xué)切片觀察

3.1 隔離淘汰病豬

為避免交叉感染，對(duì)于發(fā)病的豬只應(yīng)立即隔離，對(duì)發(fā)病嚴(yán)重的豬應(yīng)及時(shí)淘汰。

3.2 飼養(yǎng)管理

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，降低養(yǎng)殖密度，加強(qiáng)通風(fēng)，提高豬舍空氣質(zhì)量[8]；及時(shí)清理動(dòng)物糞便，保持圈舍干燥清潔；加強(qiáng)豬場(chǎng)的衛(wèi)生消毒，對(duì)于外來進(jìn)場(chǎng)人員一定要先進(jìn)行隔離，在轉(zhuǎn)群空舍時(shí)用高錳酸鉀等消毒液對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行全面的消毒，加強(qiáng)對(duì)料槽和水槽等用具的衛(wèi)生保潔工作。

3.3 治療

病程發(fā)展前期，可用阿莫西林、強(qiáng)力霉素各100 g混合600 kg飼料；中期可用20%氟苯尼考100 g、磺胺六甲氧嘧啶100 g混合200 kg飼料，連續(xù)投喂1周；后期應(yīng)考慮耐藥性因素，避開平時(shí)常喂藥物，減少細(xì)菌抗藥性。將500 g電解多維和100 g阿莫西林混合500 kg水，100 g利巴韋林、200 g磺胺六甲氧嘧啶、180 g多西環(huán)素混合在飼料中，投喂豬群1周。在即將痊愈的康復(fù)期內(nèi)，合理添加黃芪多糖，提高豬群的免疫力。

3.4 藥物預(yù)防保健

3.4.1種豬藥物預(yù)防程序

⑴母豬產(chǎn)前產(chǎn)后5 d：阿莫西林日劑量按體重20～40 mg/kg，或?qū)㈩^孢拉定按照3位成年人的劑量給豬拌料飼喂，防治乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎、產(chǎn)后熱，若母豬產(chǎn)后發(fā)熱較嚴(yán)重，可注射頭孢噻呋；

⑵母豬斷奶前后5 d：包被恩諾沙星20 g/100 kg拌料，防治乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎及斷奶應(yīng)激反應(yīng)。

3.4.2 自繁自養(yǎng)仔豬藥物預(yù)防程序

⑴出生后1～3 d：頭孢噻呋鈉0.5 g/窩/天，肌肉注射1次，防治黃痢、臍炎及皮膚感染，并注射補(bǔ)鐵針劑1次；

⑵出生后8～12 d：硫酸新霉素0.2 g/天/頭，水溶解噴灑誘食料飼喂或飲水，預(yù)防白?。?/p>

⑶斷奶前后5 d：強(qiáng)力霉素20 g/100 kg飼料，拌料或水溶解噴灑顆粒料，預(yù)防氣喘病、副豬嗜血桿菌病、附紅細(xì)胞體病等各種細(xì)菌感染；

⑷斷奶后11～15 d：包被恩諾沙星20 g/100 kg飼料，拌料，預(yù)防氣喘病、副豬嗜血桿菌病；

⑸斷奶后21～24 d：氟苯尼考20 g/100 kg拌料，或水溶解噴灑顆粒料，預(yù)防氣喘病、副豬嗜血桿菌病等各種細(xì)菌感染；

⑹斷奶后31～35 d：泰樂菌素、新霉素各20 g/100 kg拌料，或水溶解噴灑顆粒料，預(yù)防氣喘病、回腸炎；

⑺去勢(shì)、免疫、換料、轉(zhuǎn)群等：土霉素0.2%拌料，連用5 d，預(yù)防氣喘病、附紅細(xì)胞體病及各種細(xì)菌感染。