吳 姝 蔣步云 宋澤和 侯德興,3 施壽榮 賀 喜*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，飼料安全與高效利用教育部工程研究中心，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，揚州225125；3.日本鹿兒島大學農(nóng)學部，鹿兒島890-0065，日本)

抗生素自從被廣泛應用于動物生產(chǎn)以來，在防治畜禽疾病和促進生長等方面發(fā)揮了重要作用，極大地提高了養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。但隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，長期低劑量預防用藥或過量使用、濫用抗生素等現(xiàn)象普遍存在，造成畜禽體內(nèi)殘留和蓄積毒素、致病菌產(chǎn)生耐藥性、動物免疫力下降等問題日益突出，嚴重威脅人類健康。近年來超級耐藥菌的出現(xiàn)給人類敲響了警鐘，因此開發(fā)綠色、環(huán)保、無毒副殘留的抗生素的替代品已刻不容緩。

植物多酚是一類天然植物提取物，廣泛存在于植物體內(nèi)，具有多元酚結(jié)構(gòu)，是一類天然抗氧化劑，可以清除體內(nèi)有害自由基的大量產(chǎn)生，激活體內(nèi)抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)[1-2]。前人研究報道，在飼糧中添加植物多酚，不僅能改善畜禽的健康和產(chǎn)品的質(zhì)量，而且不易出現(xiàn)有害殘留和毒副作用[3-5]。因此，來源廣、成本低的植物多酚，可作為純天然、無污染、無殘留、無耐藥性的抗生素替代物，有較廣泛的市場前景和應用潛力，是未來飼料行業(yè)發(fā)展的必然趨勢，對畜牧業(yè)穩(wěn)定、持續(xù)、健康發(fā)展具有重要意義。在家禽上，植物多酚作為飼料添加劑也能促進家禽的生長性能、免疫機能和抗氧化性能，改善肉品質(zhì)和腸道形態(tài)[6-9]。但目前只有少數(shù)植物多酚成分在畜禽中的應用效果得到了證實，仍需開展更多的應用。因此本實驗室自制了一種聚合植物多酚，通過在飼糧中添加不同水平的該聚合植物多酚，探討其對黃羽肉雞抗氧化性能、腸道形態(tài)及肉品質(zhì)的影響，為植物多酚在家禽飼糧中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物多酚為本實驗室自制，主要成分為單多酚(黃酮類)和復合多酚(原花青素類)，實測總酚含量為11.59 mg/g，對二苯代苦味?；?DPPH)自由基清除能力為1.97倍Trolox當量。

1.2 試驗設計

選取健康1日齡雄性黃羽肉雞(快大型黃羽肉雞，廣東溫氏集團培育)288只，隨機分為4組，每組6個重復，每個重復12只，各重復之間體重接近(P>0.05)。對照組飼喂基礎飼糧，參照NRC(1994)和《黃雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)中黃羽肉雞營養(yǎng)需要配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1；抗生素組飼喂基礎飼糧+100 g/t抗敵素，試驗組分別飼喂基礎飼糧+500 mg/kg植物多酚(BP500組)和基礎飼糧+1 000 mg/kg植物多酚(BP1000組)。試驗期56 d，分為1～21日齡和22～56日齡2個階段。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗雞采用上、中、下3層籠養(yǎng)，鍋爐控溫(第1天33 ℃，第1周30～32 ℃，第2周27～29 ℃，第3周24～26 ℃，以后20～21 ℃)，人工光照，自然通風，自由飲水與采食并計量不限量，按正常免疫程序進行免疫接種。每天觀察記錄雞群行為及健康狀況，同時記錄每天雞舍中的溫度和濕度。

1.4 檢測指標

1.4.1 血清抗氧化指標

于21和56日齡每個重復隨機選取1只雞，翅靜脈采血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離得血清，-20 ℃冰箱保存待測。測定血清中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量，所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 5 400 000 IU，VB12 000 mg，VB215 000 mg，VB1230 mg，VD31 100 000 IU，VE 18 000 mg，VK35 000 mg，生物素 biotin 200 mg，葉酸 folic acid 500 mg，泛酸 pantothenic acid 25 000 mg，煙酸 nicotinic acid 35 000 mg，Cu 40 mg，F(xiàn)e 96 mg，Mn 105.4 mg，Zn 98 mg，I 0.9 mg，Se 0.04 mg。

2)代謝能為計算值，其余為實測值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.4.2 抗體水平

新城疫(NDV)疫苗一免于14日齡采用飲水方式進行，二免于28日齡同樣采用飲水方式完成。于一免后第14天和二免后第5、9、13天翅靜脈采血，血液經(jīng)低溫離心后分離血清，-20 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定抗NDV抗體水平。

1.4.3 腸道形態(tài)指標

于21和56日齡屠宰后，取1 cm左右空腸末端腸段和回腸中部腸段，放入10%福爾馬林中固定。取固定24 h后的腸段樣品，經(jīng)過沖水、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等處理后，以6 μm的厚度切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，最后中性樹脂封片。生物顯微鏡下觀察腸道形態(tài)變化，選取3處完整且走向平直的絨毛，測定絨毛高度(villous height)和隱窩深度(crypt depth)，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.4.4 肉品質(zhì)指標

1.4.4.1 失水率

于56日齡屠宰后，取右側(cè)胸肌，采用加壓法測定失水率。沿肌纖維垂直方向切一塊1 cm×1 cm×1 cm的方形肉粒，稱重(W1)；將肉粒置于2層醫(yī)用紗布之間，上下各墊18層濾紙(中速定性分析濾紙)，夾于鐵板中，放在改裝的鋼化允許膨脹壓縮儀的平臺上，加壓至35 kg保持5 min，撤除壓力后取肉樣稱重(W2)。

失水率(%)=[(W1-W2)/W1]×100。

1.4.4.2 滴水損失

于56日齡屠宰后，取右側(cè)胸肌，修剪為2 cm×2 cm×1 cm的肉塊，稱重(W1)，然后用細鐵絲鉤住肉樣一端，使肌纖維垂直向下，鐵絲另一端從塑料杯底部穿過，使肉樣懸于塑料杯內(nèi)，用保鮮袋裝好塑料杯，扎好袋口，置于4 ℃冰箱。24 h后取出肉樣，用潔凈濾紙輕輕拭去肉樣表層水分后稱重(W2)。把稱量后的肉樣重新掛回放入冰箱，再過24 h后取出肉樣，用濾紙拭去肉樣表層汁液后稱重(W3)。

24 h滴水損失(%)=[(W1-W2)/W1]×100；
48 h滴水損失(%)=[(W1-W3)/W1]×100。

1.4.4.3 肉色

于56日齡屠宰后，取左側(cè)胸肌，30～45 min后采用CR-400型色差儀(日本Konica Minolta公司)測定靠近骨側(cè)肌肉表面的亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值，測定3次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.4.4.4 pH

于56日齡屠宰后，取左側(cè)胸肌，45 min后將Testo-205便攜式pH計(德國Testo公司)的電極完全包埋到肉樣中，使其與肌肉中的組織液充分接觸，待pH計讀數(shù)穩(wěn)定后記錄pH值。然后將肌肉放至4 ℃冰箱中保存，24 h后再測定1次。每個肉樣測定3次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.4.5.5 肌肉MDA含量

于56日齡屠宰后，取右側(cè)胸肌10 g左右，用錫箔紙包好，液氮速凍后轉(zhuǎn)至-20 ℃冰箱保存，待測肌肉MDA含量，所用試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，對差異顯著者進行Duncan氏法多重比較。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 植物多酚對黃羽肉雞血清抗氧化指標的影響

植物多酚對21和56日齡黃羽肉雞血清抗氧化指標的影響見表2。21日齡時，BP500組和BP1000組肉雞血清中CAT活性顯著高于抗生素組(P<0.05)；56日齡時，BP1000組肉雞血清中CAT活性顯著高于其他3組(P<0.05)。

2.2 植物多酚對黃羽肉雞血清抗體水平的影響

植物多酚對肉雞抗體水平的影響見表3。一免后第14天(28日齡)時，對照組肉雞血清抗NDV抗體水平顯著高于抗生素組和BP1000組(P<0.05)，BP500組抗NDV抗體水平略高于抗生素組和BP1000組(P>0.05)。二免后第9天(37日齡)時，BP500組抗NDV抗體水平顯著高于其他各組(P<0.05)；二免后第5天(33日齡)和第13天(51日齡)時，各組抗NDV抗體水平均差異不顯著(P>0.05)。

2.3 植物多酚對黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

植物多酚對21和56日齡肉雞腸道形態(tài)的影響見圖1、圖2和表4。由圖1和圖2可知，各組空腸和回腸絨毛大致呈指狀和柱狀；對照組和抗生素組2段腸道的絨毛發(fā)育不良，大多排列不規(guī)則，粗短且有較多脫落的現(xiàn)象；而BP500組和BP1000組的2段腸道絨毛較長，排列整齊緊密，絨毛間界限清晰；總體來看，BP500組腸絨毛發(fā)育較好。

由表4可知，21日齡時，對照組的空腸隱窩深度最深，顯著大于抗生素組(P<0.05)，抗生素組最淺，BP500組、BP1000組與其他各組無顯著差異(P>0.05)；抗生素組的回腸絨毛高度最短，顯著低于對照組(P<0.05)，對照組的回腸絨毛高度最高，BP500組與BP1000組無顯著差異(P>0.05)；抗生素組和BP500組的回腸隱窩深度顯著小于對照組和BP1000組(P<0.05)；抗生素組的回腸V/C顯著高于其他3組(P<0.05)。56日齡時，BP500組的回腸絨毛高度最短，顯著低于抗生素組和BP1000組(P<0.05)，抗生素組的回腸絨毛高度最高，對照組與BP1000組無顯著顯著(P>0.05)；BP500組的回腸隱窩深度顯著低于其他3組(P<0.05)；BP500組的回腸V/C顯著高于對照組和抗素組(P<0.05)。

表2 植物多酚對黃羽肉雞血清抗氧化指標的影響

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 植物多酚對黃羽肉雞血清抗體水平的影響

2.4 植物多酚對黃羽肉雞肉品質(zhì)的影響

植物多酚對56日齡黃羽肉雞肉品質(zhì)的影響見表5。BP1000組的胸肌肉色a*值顯著高于其他各組(P<0.05)。BP500組和BP1000組的胸肌失水率顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)。BP500組和BP1000組的胸肌24 h滴水損失顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)，BP1000組的胸肌48 h滴水損失顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 植物多酚對黃羽肉雞血清抗氧化指標的影響

本研究結(jié)果表明，飼糧中添加500和1 000 mg/kg植物多酚增強了肉雞機體的抗氧化性能。舒剛[10]研究表明，竹葉黃酮顯著提高了肉雞血清SOD、CAT的活性及T-AOC，并降低了血清MDA含量；李紅等[11]研究表明，飼糧中添加0.3%的板栗總苞多酚能夠顯著提高肉雞抗氧化能力。本試驗結(jié)果與這些關(guān)于植物多酚(茶多酚)抗氧化作用的報道基本一致。植物多酚具有抗氧化作用主要是由于其結(jié)構(gòu)中包含多個易被氧化的酚羥基，可直接與自由基和氧化物結(jié)合從而清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，或促進體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，間接清除自由基[12-13]。

圖a～圖d分別為21日齡時對照組、抗生素組、BP500組和BP1000組空腸；圖e～圖h分別為21日齡時對照組、抗生素組、BP500組和BP1000組回腸。

Fig.a to Fig.d were the jejunum of control group, antibiotic group, BP500 group and BP1000 group on 21 days of age, respectively; Fig.e to Fig.h were the ileum of control group, antibiotic group, BP500 group and BP1000 group on 21 days of age, respectively.

圖1植物多酚對21日齡黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

Fig.1 Effects of botanical polyphenol on intestine morphology of yellow broilers on 21 days of age (100×)

圖a～圖d分別為56日齡時對照組、抗生素組、BP500組和BP1000組空腸；圖e～圖h分別為56日齡時對照組、抗生素組、BP500組和BP1000組回腸。

Fig.a to Fig.d were the jejunum of control group, antibiotic group, BP500 group and BP1000 group on 56 days of age, respectively; Fig.e to Fig.h were the ileum of control group, antibiotic group, BP500 group and BP1000 group on 56 days of age, respectively.

圖2 植物多酚對56日齡黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

表5 植物多酚對黃羽肉雞肉品質(zhì)的影響

3.2 植物多酚對黃羽肉雞抗體水平的影響

抗體水平在一定程度上反映了機體的體液免疫能力。本研究結(jié)果顯示，一免后第14天時，BP1000組抗NDV抗體水平顯著高于對照組；二免后第9天時，BP500組抗NDV抗體水平顯著高于其他各組，表明植物多酚對黃羽肉雞的體液免疫反應有一定影響。該試驗結(jié)果中植物多酚對機體體液免疫的促進作用與李振等[14]、馬美湖[15]和丘光恒等[16]的報道相似。大多數(shù)人認為植物多酚調(diào)節(jié)機體免疫功能的具體機制是通過植物多酚本身的抗氧化特性來保護機體的生物膜不受自由基的破壞，從而保持了膜的流動性，使機體處于一個動態(tài)的氧化還原平衡的狀態(tài)中。

3.3 植物多酚對黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

小腸絨毛是直接執(zhí)行吸收功能的部位，絨毛高度與細胞數(shù)量顯著相關(guān)。腸絨毛高度的增加能夠使小腸吸收營養(yǎng)物質(zhì)的面積增大，所以腸絨毛的長短直接關(guān)系著動物的生長發(fā)育。只有成熟的絨毛上皮細胞才具有養(yǎng)分吸收功能，因此絨毛短時，成熟細胞少，養(yǎng)分吸收能力低[17-19]。小腸隱窩是絨毛根部上皮陷入固有層形成的管狀腺體。隱窩深度主要是反映上皮細胞的生成率，上皮細胞不斷從隱窩基部向絨毛端部移動，形成具有吸收能力的新絨毛細胞，以補充正常的細胞脫落。如果此過程減慢，則基部的細胞生成率降低，使隱窩變深[20-21]。V/C則綜合反映小腸絨毛吸收功能。V/C下降，表示消化吸收功能下降，常伴隨腹瀉的發(fā)生；V/C上升，消化吸收功能增強，腹瀉率下降[22-23]。在本試驗中，BP1000組21日齡肉雞回腸絨毛高度顯著高于抗生素組；飼糧中添加500和1 000 mg/kg植物多酚可提高56日齡肉雞回腸V/C。這表明植物多酚可一定程度改善黃羽肉雞腸道形態(tài)，與孫丹鳳[9]、李登輝[24]和原澤鴻[25]的研究結(jié)果一致。

3.4 植物多酚對黃羽肉雞肉品質(zhì)的影響

肌肉肉色a*值的大小說明肌肉中肌紅蛋白含量的高低和存在的狀態(tài)；肌肉系水力是肌肉組織保持水分的能力，是作為評定禽肉肉質(zhì)的重要指標，目前多采用失水率、滴水損失、烹調(diào)損失或熟肉率來評定家禽肌肉系水力；脂類過氧化是肉品質(zhì)降低的主要原因之一，MDA是肌肉中脂類過氧化最重要的產(chǎn)物之一。蔣守群[7]在嶺南黃羽肉雞飼糧中添加40 mg/kg大豆異黃酮可使宰后24 h時肉雞胸肌的肉色a*值略有增高，提高了胸肌系水力，并降低了胸肌中MDA含量。宋揚等[26]報道，飼糧中添加泡桐花黃酮提取物可改善愛拔益加肉雞肌肉的系水力。在本試驗中，BP1000組肉色a*值顯著高于其他3組，表明植物多酚可一定程度上抑制肌紅蛋白過氧化成高鐵蛋白，使雞肉保持肉色的穩(wěn)定性；BP500組和BP1000組黃羽肉雞肌肉失水率和滴水損失均顯著降低，表明植物多酚可提高肌肉對水分的束縛能力；飼糧中添加植物多酚有降低雞胸肌中MDA含量的趨勢，說明植物多酚可在一定程度上抑制脂類過氧化，保持雞肉的新鮮程度。總之，本試驗結(jié)果與國內(nèi)一些關(guān)于植物多酚改善雞肉品質(zhì)的報道基本一致。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加500和1 000 mg/kg植物多酚均顯著提高了黃羽肉雞血清抗氧化酶CAT的活性，從而增強了黃羽肉雞的抗氧化性能；其中添加1 000 mg/kg的效果更優(yōu)。

② 飼糧中添加500和1 000 mg/kg植物多酚均在一定程度上提高了黃羽肉雞抗NDV抗體水平。

③ 飼糧中添加500和1 000 mg/kg的植物多酚均能改善肉雞腸道形態(tài)，且添加1 000 mg/kg的效果更優(yōu)。

④ 飼糧中添加500和1 000 mg/kg植物多酚均能夠改善黃羽肉雞肉品質(zhì)，且添加1 000 mg/kg的效果更優(yōu)。

⑤ 綜合考慮，飼糧中植物多酚的添加量以1 000 mg/kg為宜。