馮肖莉，李學(xué)文，王艷

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】鹽脅迫是影響植物生長(zhǎng)分布、產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素之一，選育適宜于鹽堿地生長(zhǎng)并且具有較高經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的植物品系，是利用和改良鹽堿地經(jīng)濟(jì)有效的措施之一[1-2]。鹽角草(SalicorniaeuropaeaL.)是迄今報(bào)道的最為耐鹽陸生高等真鹽生植物之一，為藜科鹽角草屬(SaliconiaL)，一年生草本植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，在蔬菜、食用油、飼料和制藥等方面具有很廣闊的應(yīng)用前景[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物細(xì)胞的全能性使其在離體條件下具備再生形成完整植株的潛能[4-5]，然而有些植物的離體再生很容易，有些植物則很困難。有關(guān)藜科鹽角草屬植物的組織離體培養(yǎng)鮮有報(bào)道，前期史秀玲等[6]以鹽角草完整的成熟種子為起始培養(yǎng)材料，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)及分化，建立了鹽角草的體外再生體系。【本研究切入點(diǎn)】研究發(fā)現(xiàn)，愈傷細(xì)胞的過(guò)度分裂會(huì)導(dǎo)致體細(xì)胞的無(wú)性系變異[7-8]，經(jīng)愈傷組織階段的離體再生往往會(huì)引起遺傳的不穩(wěn)定性，因而器官發(fā)生途徑獲得的再生植株往往具有較高的穩(wěn)定性[9-11]。一個(gè)高效的器官發(fā)生途徑既可以快速擴(kuò)繁優(yōu)良品種，同時(shí)也可用于高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。研究鹽生植物鹽角草同化枝不定芽的誘導(dǎo)與增殖。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過(guò)對(duì)不同植物激素的篩選以確定直接誘導(dǎo)鹽角草不定芽與增殖的最適培養(yǎng)基，為鹽堿地的生態(tài)改良及篩選與鑒定鹽生植物中重要的抗鹽基因奠定基礎(chǔ)，為從細(xì)胞水平研究耐鹽植物的適應(yīng)性機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 材料

外植體：野生鹽角草(SalicorniaeuropaeaL.)植株采自五家渠103團(tuán)10連水庫(kù)(N44.53，E87.57，海拔374 m)，整株植株帶土挖回。

1.1.2 試劑

噻苯隆苯基脲(TDZ)、生長(zhǎng)素α-萘乙酸(NAA)、細(xì)胞分裂素6-芐基腺嘌呤(6-BA)均購(gòu)于BBI Life Sciences公司；蔗糖、瓊脂、氯化鈉等均為天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司購(gòu)買的分析純化學(xué)藥品。

1.1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的TDZ、6-BA和NAA，設(shè)計(jì)5種不同激素配比誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1、MS2、MS3、MS4和MS5。由于鹽角草的自然生境為鹽堿地，為保證細(xì)胞滲透壓的穩(wěn)定，以上5種培養(yǎng)基中分別加入4種不同濃度的NaCl(0 、100、150 和200 mM)以篩選鹽角草同化枝不定芽誘導(dǎo)的最佳需鹽濃度。表1

表1 鹽角草直接不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基
Table 1 Media used for direct adventitious bud induction of S. europaea

培養(yǎng)基編號(hào)No. of media激素濃度Phytohormone concentration (mg/L)TDZ6-BANAAMS10.50.10.4MS2110.2MS3200.1MS430.50MS541.50.5

1.2 方 法

1.2.1 鹽角草外植體消毒處理

選擇健壯、幼嫩且無(wú)病蟲害的鹽角草同化枝組織，用自來(lái)水反復(fù)沖洗3 h，濾紙吸干，用75%酒精潤(rùn)洗30 s，10%次氯酸鈉處理15 min，無(wú)菌水沖洗4遍進(jìn)行表面消毒滅菌。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將消毒處理后的鹽角草同化枝切成長(zhǎng)1.0 cm的小段，將切好的同化枝組織接種于上述誘芽分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種5～6個(gè)外植體。培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，并記錄不定芽的顏色、質(zhì)地及生長(zhǎng)狀況。按下列公式計(jì)算：不定芽誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)) ×100%。

1.2.3 不定芽繼代及增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)分化的不定芽從基部切下，接種至不同激素濃度配比的增殖培養(yǎng)基中，基本培養(yǎng)基為含200 mM NaCl的MS培養(yǎng)基，附加不同濃度的TDZ和NAA，共設(shè)置5種培養(yǎng)基B1、B2、B3、B4和B5，每種培養(yǎng)基接種6瓶，每瓶接種5～6個(gè)幼芽，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖率。計(jì)算：增殖率=(分化出的不定芽數(shù)/接種不定芽塊數(shù))×100%。表2

表2 不定芽增殖培養(yǎng)基
Table 2 The medium for adventitious bud proliferation

培養(yǎng)基編號(hào)No. of media激素濃度Phytohormone concentration (mg/L)TDZNAAB100.1B21.60.1B31.80.1B42.00.1B52.50.1

1.2.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基中均附加瓊脂7.0 g/L，蔗糖30 g/L。以上實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件溫度均為(25±1)℃，光照時(shí)數(shù)16 h/d，光強(qiáng)30～40 μmol/(m2·S)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；采用SPSS 20.0方差分析和Duncan檢驗(yàn)對(duì)各處理均值進(jìn)行多重比較，兩組間比較以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物激素組合與不同NaCl濃度組合對(duì)鹽角草不定芽誘導(dǎo)的影響

鹽角草同化枝培養(yǎng)20 d后可見外植體周圍誘導(dǎo)出現(xiàn)致密淺綠色的細(xì)胞團(tuán)塊(圖1A)，其生長(zhǎng)迅速，約20 d后形成不定芽(圖1B)。不同種類激素及濃度和不同鹽濃度組合的20種培養(yǎng)基誘芽結(jié)果顯示，20種培養(yǎng)基中，MS3(MS+2.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA)培養(yǎng)基的有效平均誘芽率達(dá)22.40%，顯著高于(P<0.05)其余組。NaCl濃度對(duì)鹽角草不定芽的誘導(dǎo)率也具有顯著影響，隨著NaCl濃度的增加，不同激素配比的5種培養(yǎng)基中不定芽的誘導(dǎo)率也逐漸增加。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到200 mM 時(shí)有效誘芽率顯著高于(P<0.05)其余濃度，平均誘導(dǎo)率為18.9%。在最適200 mM NaCl和最適MS3培養(yǎng)基中，鹽角草同化枝的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)32.4%，為最適誘芽培養(yǎng)基。表3，圖1

A 鹽角草同化枝20 d后誘導(dǎo)的細(xì)胞團(tuán)塊； B 鹽角草同化枝40 d后分化的不定芽

A Adventitious buds induced by the branches ofS.europaea；B Proliferation of adventitious buds

圖1 鹽角草同化枝不定芽分化
Fig.1 Differentiation of adventitious bud of S. europaea

2.2 不同TDZ濃度對(duì)不定芽繼代和增殖的影響

為了比較TDZ對(duì)不定芽增殖的影響，將鹽角草不定芽繼代培養(yǎng)在含有0.1 mg/L NAA和不同TDZ濃度的培養(yǎng)基中，且培養(yǎng)基中均添加200 mM NaCl。研究表明，在調(diào)整TDZ濃度后各組之間不定芽增殖率在498.6%～619.5%，各組無(wú)顯著差異(P>0.05)，且不定芽均呈現(xiàn)出形態(tài)飽滿，顏色翠綠，但明顯可以看出，隨著TDZ濃度的降低，不定芽出現(xiàn)了一定程度變紅的趨勢(shì)(圖2A-E)。由于前期進(jìn)行再生芽誘導(dǎo)時(shí)選用的是2 mg/L TDZ，增殖頻率也是2 mg/L TDZ的B4培養(yǎng)基略高，因此，進(jìn)行不定芽增殖時(shí)統(tǒng)一選擇2 mg/L TDZ(圖2D)。不定芽在B4培養(yǎng)基中培養(yǎng)約40 d后，增殖迅速，且不定芽長(zhǎng)勢(shì)較壯(圖2F)。表4，圖2

表4 TDZ下鹽角草不定芽增殖頻率變化
Table 4 The influence of TDZ on the induction frequency of the adventitious bud of S. europaea

培養(yǎng)基Medium不定芽增殖率Proliferation rate of adventitious buds (%)B1502.2 ±55.94B2498.6± 39.27B3550.5 ± 79.93B4619.5 ± 45.07B5542.6±25.50

A 0 mg/L TDZ；B 1.6 mg/L TDZ；C 1.8 mg/L TDZ；D 2.0 mg/L TDZ；E 2.5 mg/L TDZ；F 不定芽增殖

A 0 mg/L TDZ；B 1.6 mg/L TDZ；C 1.8 mg/L TDZ；D 2.0 mg/L TDZ；E 2.5 mg/L TDZ；F Proliferation of adventitious buds

圖2 鹽角草不定芽的繼代和增殖培養(yǎng)
Fig.2 Differentiation of Salicornia adventitious buds induction

3 討 論

植物離體器官在合適的培養(yǎng)條件下，不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段從外植體上直接分化形成不定芽的途徑稱為直接器官發(fā)生[12-14]，而外源激素的組合及濃度配比是影響外植體分化方向的重要因素。不同種類和濃度的植物激素對(duì)同一植物不同類型的外植體而言，敏感度差異也不盡相同。史秀玲[6]以鹽角草2～3周齡無(wú)菌苗下胚軸和子葉作為外植體接種于含有不同濃度的BA與NAA組合、TDZ與IAA組合和TDZ、BA與NAA組合的培養(yǎng)基中，均未誘導(dǎo)出不定芽；而以成熟種子為起始培養(yǎng)材料，在添加TDZ 0.1 mg/L與NAA 1 mg/L的培養(yǎng)基上，通過(guò)愈傷組織途徑獲得了不定芽。研究選取野外生長(zhǎng)的鹽角草肉質(zhì)化同化枝為外植體，使用TDZ 2.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L的激素組合，成功誘導(dǎo)了不定芽的發(fā)生。TDZ是一種合成的雜環(huán)芳香脲，具有生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素雙重作用[15]，在許多植物離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中被證明是一種對(duì)不定芽誘導(dǎo)極為有效的植物激素[16]，且離體再生往往受到較高濃度TDZ的促進(jìn)[17-21]。研究也發(fā)現(xiàn)，在添加NAA和不同濃度TDZ的MS培養(yǎng)基中均誘導(dǎo)出了不定芽，其中高濃度的TDZ(2.0 mg/L)可高頻率的直接誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，可能正如史秀玲[6]的研究，較高濃度的TDZ抑制了鹽角草愈傷組織的形成，但當(dāng)TDZ濃度達(dá)到3～4 mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)也出現(xiàn)了顯著的抑制。

鹽角草屬真鹽生植物，適宜的鹽濃度會(huì)促進(jìn)鹽生植物的生長(zhǎng)[22-23]，也有研究顯示[24-26]適當(dāng)濃度的NaCl能有效促鹽生植物愈傷組織的形成。史秀玲等[6]和余桂紅等[27]分別在培養(yǎng)基中添加170 mM和137 mM的NaCl均提高了藜科鹽生植物鹽角草和海篷子愈傷組織分化為不定芽的頻率。研究中，鹽角草在添加不同濃度NaCl的培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)頻率不同，隨著NaCl濃度增加而升高，其中200 mM NaCl組誘導(dǎo)率最高，平均誘導(dǎo)率達(dá)18.9%。研究中，不添加NaCl的最適激素配比培養(yǎng)基中的誘芽率僅為9.8%，而添加200 mM NaCl后增加至32.4%，NaCl濃度是不定芽誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵因素，200 mM NaCl為鹽角草不定芽誘導(dǎo)及增殖最適鹽濃度。

4 結(jié) 論

研究以鹽生植物鹽角草同化枝為外植體，通過(guò)直接器官發(fā)生途徑篩選出了鹽角草不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基，以MS為基本培養(yǎng)基附加2.0 mg/L TDZ及0.1 mg/L NAA，平均誘芽率達(dá)22.40%。不定芽誘導(dǎo)的最適鹽(NaCl)濃度為200 mM，平均誘導(dǎo)率為18.9%。鹽角草同化枝在200 mM NaCl的MS3培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率和增殖率可達(dá)32.4%，經(jīng)過(guò)30～40 d的培養(yǎng)，不定芽增殖率可達(dá)619.5%，鹽角草不定芽誘導(dǎo)及增殖最適培養(yǎng)基均為：MS+2.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA+200 mM NaCl。一定濃度的TDZ、NAA及NaCl組合可通過(guò)直接器官發(fā)生途徑有效誘導(dǎo)鹽角草同化枝不定芽的產(chǎn)生和增殖。