?？∑?，黃金容，苗小榮，王道波* ，楊麗濤 ，李楊瑞

(1.玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，廣西玉林 537000;2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西玉林 537000;3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530005;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，廣西南寧 530007)

【研究意義】甘蔗是我國(guó)重要的糖料作物，也是廣西的支柱經(jīng)濟(jì)作物。全球60%的食糖來源于甘蔗，而我國(guó)甘蔗糖產(chǎn)量占全國(guó)食糖總產(chǎn)量的比例高達(dá)90%以上［1］。蔗糖分是衡量甘蔗品種優(yōu)劣的最重要指標(biāo)之一，探討甘蔗體內(nèi)與蔗糖代謝相關(guān)酶的酶活水平、消長(zhǎng)規(guī)律和基因的遺傳多樣性，可為選育高糖甘蔗品種奠定理論基礎(chǔ)。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)及其在蔗莖中的積累過程十分復(fù)雜，是蔗糖合成和分解酶類在植物體內(nèi)共同協(xié)作調(diào)節(jié)的結(jié)果，轉(zhuǎn)化酶 (Invertase，INV)是高等植物體內(nèi)控制蔗糖分解的關(guān)鍵酶，在蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、貯藏和分配中起作用［2］。而轉(zhuǎn)化酶抑制子(Invertase inhibitor，InvInh)是體內(nèi)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶活性的關(guān)鍵酶［3］。因此，對(duì)甘蔗InvInh家族基因進(jìn)行篩選、克隆和組織特異性表達(dá)研究，對(duì)進(jìn)一步研究InvInh對(duì)轉(zhuǎn)化酶的抑制機(jī)理及其在探明蔗糖積累中所起的作用均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】InvInh是轉(zhuǎn)化酶翻譯后調(diào)節(jié)的一個(gè)重要因子，存在于植物發(fā)育的特定階段，且只對(duì)酸性轉(zhuǎn)化酶起抑制作用［4］。InvInh家族基因可分為液泡轉(zhuǎn)化酶抑制子(Vacuolar invertase inhibitors，VIFs)、細(xì)胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶抑制子(Cell wall invertase inhibitors，CIFs)和定位不明確或同時(shí)對(duì)二者都具有抑制作用的抑制子(C/VIF)［5］。目前，已經(jīng)從番茄、擬南芥、大豆、玉米和鐵皮石斛等植物中克隆到InvInh基因，它們編碼的氨基酸序列不保守，在不同物種間變異較大，但該類蛋白N端都具有4個(gè)不對(duì)稱的α螺旋結(jié)構(gòu)和4個(gè)保守的Cys位點(diǎn)［2，6］。InvInh和INV以離子鍵相結(jié)合，能形成InvInh/INV復(fù)合物，當(dāng)純化的InvInh蛋白加入煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，INV酶活性受到抑制［7］。蔗糖濃度［8］、pH 值［9］和 SnPK 磷酸化［10］等是影響InvInh與INV結(jié)合的重要調(diào)控因子，它們或通過與InvInh蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，抑制其與INV結(jié)合，或影響InvInh與INV的結(jié)合效率。InvInh酶活性具有劑量依賴型，其使INV酶活性降低50%的 Ki值為 3.82 ×10－5mol/L［11－12］。課題組前期從甘蔗中克隆到一個(gè)SoInvInh1基因，相關(guān)性分析表明在甘蔗成熟期蔗莖中SoInvInh1基因可能與酸性轉(zhuǎn)化酶活性密切相關(guān)［13］。蔗莖中SAI酶和NI酶活性降低有利于蔗糖積累，而節(jié)間細(xì)胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(CIN)酶活性提高，有利于蔗糖從低濃度節(jié)間向高濃度節(jié)間的運(yùn)輸。而節(jié)間SoInvInh2基因表達(dá)量與CIN酶活性呈正相關(guān)，推測(cè)該基因可能是節(jié)間CIN酶活性重要調(diào)節(jié)因子［14］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期對(duì)甘蔗INV家族基因表達(dá)和功能研究的基礎(chǔ)上，擬從NCBI基因庫(kù) Genbank篩選 InvInh基因，利用Vector NTI 11.0軟件在InvInh基因核苷酸序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，采用同源克隆技術(shù)從甘蔗中克隆InvInh家族基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)玉米ZmInvInh2基因核苷酸序列，采用同源克隆和熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，Tail-PCR)技術(shù)，以甘蔗品種GT28幼莖cDNA為模板，克隆甘蔗InvInh家族基因成員，利用生物信息學(xué)軟件分析InvInh蛋白的理化特性和蛋白結(jié)構(gòu)，并利用qRT-PCR分析InvInh在甘蔗不同組織部位的表達(dá)特性，為后續(xù)深入研究該基因在甘蔗蔗糖代謝和積累中的作用的提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以特早熟、特高糖、高產(chǎn)、宿根性好和抗逆性強(qiáng)，在廣西南寧地區(qū)易于開花的甘蔗品種桂糖28號(hào)(GT28)為材料［15］。于2012年1月20日種植于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院甘蔗資源圃，分別在甘蔗不同生育期取樣:伸長(zhǎng)期(自甘蔗開始拔節(jié)起至伸長(zhǎng)基本停止的時(shí)期)、工藝成熟期(蔗莖中蔗糖分積累達(dá)到最高峰，蔗汁純度最適合壓榨制糖的時(shí)期)、生理成熟前期(甘蔗生長(zhǎng)錐分化為花芽到未抽穗的時(shí)期)、生理成熟后期(甘蔗抽穗之后到開花結(jié)實(shí)時(shí)期)，相應(yīng)的取材時(shí)間為2012年8月22日、2012年12月22日、2013年1月22日和2013年2月22日。采樣時(shí)以頂端第1片完全展開葉為+1葉，即成熟葉，處于頂端中心位置還沒有展開的葉為幼葉，甘蔗靠近莖基部的葉片為老葉。幼莖為幼葉包裹的未成熟莖，成熟莖為蔗莖中部已經(jīng)完全成熟的莖，老莖為靠近蔗莖基部的莖。

1.2 試劑和儀器

RNA提取TRIzol試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas(美國(guó));Ex Taq酶、dNTPs、pMD18-T 載體、Genome Walking Kit、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser和SYBR Premix Ex TapⅡ購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。供試特異引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀(美國(guó))。

1.3 轉(zhuǎn)化酶抑制子SoInvInh2全長(zhǎng)序列的克隆

1.3.1 5'片段克隆 以報(bào)道的玉米 ZmInvInh2(登錄號(hào)EU951975)基因的cDNA序列，運(yùn)用NCBI網(wǎng)站上Blastn程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，選取與甘蔗親緣關(guān)系較近植物的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，在其保守性較高的區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物H2F1和H2R1(表1)，用于SoInvInh2中間片段的克隆。以甘蔗幼莖cDNA為模板，引物H2F1和H2R1的PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收純化后，將其連接到pMD18-T體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選白色單菌落，采用通用引物M13進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，將能擴(kuò)增出目的條帶的菌液，送深圳華大基因研究院進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 甘蔗SoInvInh2基因的克隆和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primers sequences for cloning and qRT-PCR of SoInvInh2 gene

1.3.2 3'片段克隆 以甘蔗幼莖RNA 為模板，利用引物GZS反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依據(jù)上一步克隆到的5'片段序列，設(shè)計(jì)3條特異性上游引物H2F2、H2F3和H2F4(表1)。下游引物為XP1，按照Genome Walking Kit試劑盒說明書進(jìn)行Tail-PCR擴(kuò)增。第1輪PCR擴(kuò)增:以甘蔗幼莖cDNA為模板，擴(kuò)增體系為 50 μl，含 cDNA 模板 4.0 μl、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)8.0 μl、10 × LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)5.0μl、LA Taq(2.5 U/μl)0.5 μl、上游引物 H2F2(100 pmol/μl)1.0 μl、下游引物 XP1(10 pmol/μl)1.0 μl、ddH2O 30.5 μl。其 PCR 擴(kuò)增條件如下:94℃ 1 min，98℃ 1 min;94℃ 30 s，61.5℃1 min，72 ℃ 2.5 min，進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s，25℃ 3 min，72 ℃ 2.5 min;94 ℃ 30 s，61.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，94 ℃ 30 s，61.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，94 ℃ 30 s，42 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，進(jìn)行15個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，4℃保存。第2輪PCR擴(kuò)增:取1.0 μl上述反應(yīng)的PCR產(chǎn)物作為模板，以H2F3和XP1為引物，引物H2F3的退火溫度為60℃，擴(kuò)增反應(yīng)液和擴(kuò)增體系同第1輪擴(kuò)增。第3輪擴(kuò)增體系與第2輪相同，引物H2F4退火溫度為61.5℃。取第3輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到pMD18-T載體，經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增檢測(cè)后，送深圳華大基因研究院測(cè)序驗(yàn)證。

利用軟件ContigExpress將克隆到的2個(gè)核苷酸序列進(jìn)行拼接，然后利用 NCBI網(wǎng)站上的 Open Reading Frame Finder對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行編碼區(qū)分析。在編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物:H2F11、H2F12、H2R11和H2R12(表1)。分別以花序軸和花序cDNA為模板，引物組合:A:H2F11和 H2R12;B:H2F12和H2R11;C:H2F12和 H2R12。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s，56～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析3對(duì)引物的PCR擴(kuò)增特異性，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用 http://web.expasy.org/protparam 分析編碼蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點(diǎn);利用http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html分析跨膜結(jié)構(gòu);利用http://linux1.softberry.com分析蛋白的亞細(xì)胞定位;利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 分析蛋白質(zhì)信號(hào)肽;利用 http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan 分析蛋白的活性位點(diǎn);利用Vector NTI Advance 11.0進(jìn)行基因氨基酸序列同源性比對(duì)分析;利用MEGA7.0軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 熒光定量PCR

經(jīng)引物擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率驗(yàn)證，SoInvInh2基因熒光定量引物為T2F22和T2R22(表1)，內(nèi)參引物和qRT-PCR擴(kuò)增體系參照牛俊奇等［13］的方法。采用2－ΔΔCT法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SoInvInh2基因的克隆

從引物H2F1和H2R1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果可見(圖1-A)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰且單一，序列測(cè)序結(jié)果為623 bp。利用Blastn進(jìn)行同源性比對(duì)分析，該序列與高粱(XM002447788)和玉米(EU966246)轉(zhuǎn)化酶抑制子同源性分別為86%和85%，說明克隆到的是甘蔗InvInh基因，該基因與甘蔗SoInvInh1(KF575175)核苷酸序列同源性為60%，因此克隆到的是一個(gè)新的甘蔗InvInh基因家族成員，命名為:SoInvInh2。該基因在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)號(hào)為 KF575170。利用Tail-PCR擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖1-B所示，擴(kuò)增條帶單一，序列測(cè)序結(jié)果為327 bp。

利用ContigExpress將5'和3'片段核苷酸序列進(jìn)行拼接，獲得SoInvInh2全長(zhǎng)cDNA序列，全長(zhǎng)927 bp，其中編碼區(qū)序列為651 bp，編碼216個(gè)氨基酸，5'UTR(Untranslated Region，非翻譯序列)長(zhǎng)2 bp，3'UTR長(zhǎng)274 bp，并帶有真核生物典型的poly A尾巴(圖2)。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product

分別以花序軸和花序cDNA為模板，引物對(duì)A、B和C的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)如圖3所示。引物對(duì)A擴(kuò)增出的條帶，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為非目的基因。引物對(duì)B在花序軸cDNA擴(kuò)增的條帶清新，但在花序cDNA中擴(kuò)增的結(jié)果不理想。而引物對(duì)C在花序軸和花序cDNA中均能擴(kuò)增出目的條帶，經(jīng)測(cè)序序列大小為651 bp，與拼接結(jié)果的核苷酸序列同源性為99.8%，說明引物對(duì)C可以用于擴(kuò)增SoInvInh2基因編碼區(qū)序列。而以甘蔗gDNA為模板，引物對(duì)C的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序大小也為651 bp，與SoInvInh2基因的cDNA核苷酸序列同源為100%，說明SoInvInh2基因不含內(nèi)含子序列。

圖2 SoInvInh2基因的cDNA序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of SoInvInh2 gene

圖3 SoInvInh2開放閱讀框驗(yàn)證Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of SoInvInh2 gene

2.2 SoInvInh2蛋白的生物信息學(xué)分析

利用BioXM 2.6軟件對(duì)SoInvInh2編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行分析，序列含A(腺嘌呤)111個(gè)、G(鳥嘌呤)186個(gè)、C(胞嘧啶)270個(gè)、T(胸腺嘧啶)84個(gè)，GC含量為70.05%，A+T含量為29.95%。該蛋白預(yù)測(cè)分子量為22.98 kD，等電點(diǎn)pI為7.8。帶負(fù)電荷的氨基酸占19.44%，帶正電荷的氨基酸占10.19%。SignalP4.1預(yù)測(cè)表明，SoInvInh2蛋白不存在信號(hào)肽。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為32.34，為穩(wěn)定蛋白。平均疏水性為 －0.034，為親水性蛋白。TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)該蛋白在N端具有跨膜結(jié)構(gòu)。49～206 aa是PMEI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，該蛋白屬于InvI/PMEI家族成員。該蛋白含有3個(gè)糖基化位點(diǎn):59～62、96～99和106～109 aa;3個(gè)絡(luò)蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn):62～65、78～81和141～144 aa;丙氨酸富集區(qū):69～157 aa。

利用 http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred 對(duì) So-InvInh2編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4)，二級(jí)結(jié)構(gòu)有8個(gè) α-螺旋，不含 β-折疊。其中 α-螺旋占72%、無規(guī)則卷曲占23%，延伸鏈占5%。利用Phyre2預(yù)測(cè)SoInvInh2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有4個(gè)α-螺旋。

運(yùn)用Vector NTI Advance 11軟件上的AlignX對(duì)不同植物的InvInh的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，甘蔗SoInvInh2與玉米、高粱、水稻、擬南芥和馬鈴薯InvInh2的氨基酸序列的同源性分別為81%、80%、60%、37%和35%。InvInh2s蛋白在5'端同源性較低，在單子葉和雙子葉植物之間，氨基酸序列同源性低于40%。9個(gè)不同來源的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖5所示，InvInh2s蛋白在3'端同源性較高，其中4個(gè)保守的 Cys位點(diǎn)，分別位于第2、3、7和8個(gè)α-螺旋上。

2.3 InvInhs系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA7.0軟件構(gòu)建InvInhs系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，植物InvInhs可以聚為4類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。其中Ⅰ類為單子葉植物InvInh2，Ⅱ類為雙子葉植物InvInh2，Ⅲ類為單子葉植物InvInh1，Ⅳ為雙子葉植物InvInh1。甘蔗SoInvInh1和SoInvInh2分別屬于Ⅲ類和Ⅰ類。從進(jìn)化關(guān)系看，Ⅰ類和Ⅱ類進(jìn)化關(guān)系比較近，而與同是單子葉植物類的Ⅲ類的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，說明InvInhs蛋白又可以分為2個(gè)大類:Ⅰ和Ⅱ歸為一類、Ⅲ和Ⅳ又歸為另一類。

2.4 SoInvInh2基因在甘蔗不同生長(zhǎng)期的時(shí)空表達(dá)分析

圖4 SoInvInh2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Predicted secondary structure of SoInvInh1 protein

圖5 SoInvInh2氨基酸序列與其他物種氨基酸序列多重比對(duì)Fig.5 Alignment of SoInvInh2 its homologous based on amino acid sequences

在甘蔗伸長(zhǎng)期(圖7 A)，SoInvInh2的表達(dá)量在成熟莖中表達(dá)量最高，在成熟葉中最低，成熟莖中基因表達(dá)量是成熟葉中的70.9倍。在葉中SoInvInh2表達(dá)量呈現(xiàn)出老葉＞幼葉＞成熟葉，在莖中SoInvInh2表達(dá)量呈現(xiàn)出成熟莖＞老莖＞幼莖。在甘蔗工藝成熟期(圖7-B)，SoInvInh2在幼葉中表達(dá)量最高，老葉次之，成熟莖中表達(dá)量最低。葉中該基因表達(dá)呈“幼葉＞老葉＞成熟葉”的趨勢(shì)，其中SoInvInh2在幼葉中基因的表達(dá)量是老葉的2.5倍，是成熟葉的2.2倍。在莖中SoInvInh2表達(dá)量呈現(xiàn)出“幼莖＞老莖＞成熟莖”，幼莖中基因表達(dá)量是成熟莖中的3.4倍。在甘蔗生理成熟前期(圖7-C)，SoInvInh2在莖中基因表達(dá)量呈幼莖＞成熟莖＞老莖。SoInvInh2表達(dá)量在幼莖中最大，老葉中次之，成熟葉中最低。在甘蔗生理成熟后期(圖7-D)，葉中SoInvInh2表達(dá)量表現(xiàn)為:老葉＞幼葉＞成熟葉，莖中表現(xiàn)為:成熟莖＞幼莖＞老莖。SoInvInh2在老葉中基因相對(duì)表達(dá)量最大，花序中次之，幼莖中最低，其中老葉中基因表達(dá)量是幼莖中的11.7倍。SoInvInh2在花序中基因表達(dá)量是花序軸中1.6倍。

3 討論

克隆基因3'側(cè)翼未知序列常采用3'RACE試劑盒，一般都能克隆獲得基因未知核苷酸序列，但本研究前期采用3'RACE試劑盒并未克隆到SoInvInh2基因3'片段序列，而采用Tail-PCR技術(shù)能成功克隆出。Tail-PCR技術(shù)雖然需要較多引物組合，擴(kuò)增條件精細(xì)，但其操作簡(jiǎn)便、快捷、擴(kuò)增特異性高，常用于基因側(cè)翼序列的克?。?6］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn) SoInvInh2基因的核苷酸序列GC含量高達(dá)70%以上。PCR擴(kuò)增GC含量較高的基因，退火時(shí)核苷酸序列容易形成復(fù)雜的發(fā)夾結(jié)構(gòu)從而干擾擴(kuò)增，可以適當(dāng)減少退火時(shí)間、或在PCR反應(yīng)體系中加入亞甲基砜和甜菜堿都能提高引物的擴(kuò)增效率［17］。本研究也證明采用Genome Walking Kit試劑盒和引物XP1組合適用于擴(kuò)增甘蔗高GC含量的基因。

InvInh蛋白具有4個(gè)不對(duì)稱的α螺旋結(jié)構(gòu)和4個(gè)保守的Cys位點(diǎn)，它們?cè)诜€(wěn)定InvInh蛋白構(gòu)型和功能中起作用。4個(gè)不對(duì)稱α螺旋在維持InvInh蛋白結(jié)構(gòu)的完整性中起重要作用，而4個(gè)α螺旋結(jié)合區(qū)是與酸性轉(zhuǎn)化酶結(jié)合的重要區(qū)域［18］。4個(gè)保守的Cys位點(diǎn)，能形成2個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，具有穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用。而分子內(nèi)二硫鍵內(nèi)被DTT破壞，InvInh 蛋白即失去抑制作用［2］。Hothorn 等［9］進(jìn)一步研究證實(shí)煙草InvInh蛋白在高溫和低pH值下能保持穩(wěn)定，就是由于Cys間形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定二硫橋的緣故。本研究克隆到的SoInvInh2蛋白具有4個(gè)不對(duì)稱的α螺旋結(jié)構(gòu)和4個(gè)保守的Cys位點(diǎn)，因此推測(cè)該蛋白可能具有抑制INV酶活性的作用。

圖6 InvInhs進(jìn)化關(guān)系分析Fig.6 Phylogenetic tree of InvInhs protein

圖7 甘蔗不同生長(zhǎng)時(shí)期SoInvInh2表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of SoInvInh2 at different growth stages of sugarcane

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，植物InvInhs蛋白可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個(gè)亞家族。從進(jìn)化關(guān)系看，Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ亞家族蛋白的親緣關(guān)系較近，而Ⅰ和Ⅲ亞家族蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與Di Matteo等［5］將InvInh分成液泡轉(zhuǎn)化酶抑制子VIF和細(xì)胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶CIF的分類結(jié)果相一致，即VIF與CIF家族蛋白之間所推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性較低。由于植物液泡轉(zhuǎn)化酶(SAI)和細(xì)胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(CIN)都是多家族基因，提取、分離和純化這兩種酶比較困難，且InvInh/INV復(fù)合物具有高度特異性，InvInh對(duì)不同物種INV抑制作用存在較大差異［19］。因此Ⅰ和Ⅱ亞家族成員是屬于VIF亞家族，還是屬于CIF亞家族，還需要進(jìn)一步研究。但該類蛋白具有明顯的共同特征:屬于非糖基化蛋白，其分子量為17～23 kD;具熱穩(wěn)定性，短時(shí)高溫仍具有抑制INV活性的作用;對(duì)INV具有交叉抑制作用［20］。

基因表達(dá)模式分析可為基因功能的揭示提供重要線索。本研究結(jié)果表明SoInvInh2基因表達(dá)具有組織表達(dá)特異性，但該基因在甘蔗不同生育期葉和莖中的表達(dá)模式無明顯規(guī)律。前期研究表明甘蔗成熟期節(jié)中SoInvInh2基因與CIN酶活性呈正相關(guān)性，表明二者可能存在協(xié)同表達(dá)［14］。在煙草中過表達(dá)SoInvInh2基因，轉(zhuǎn)基因植株中CIN酶活性在葉、根和莖中的酶活性與SoInvInh2基因表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明過表達(dá)SoInvInh2基因，可能翻譯成了有活性的SoInvInh2蛋白，從而抑制了 CIN的酶活性［21］。在番茄中沉默InvInh1基因的表達(dá)，可以提高CIN酶活性，抗寒性提高。而過表達(dá)InvInh1，能抑制 CIN酶活性，己糖含量降低，對(duì)低溫敏感［21－22］。在番茄、大豆和擬南芥研究中都發(fā)現(xiàn)，CIF能抑制CIN酶活性，能延緩細(xì)胞衰老和增加種子重量［24－25］。大量研究表明，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達(dá)InvInh基因，能抑制酸性轉(zhuǎn)化酶的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)蔗糖代謝和庫(kù)強(qiáng)。下一步將構(gòu)建SoInvInh2基因正義和RNAi干擾植物表達(dá)載體，并將其導(dǎo)回甘蔗中。通過轉(zhuǎn)基因植株性狀表現(xiàn)，結(jié)合InvInh2基因表達(dá)特性驗(yàn)證甘蔗SoInvInh2基因的功能，闡明甘蔗糖分積累過程中InvInh與INV的互作機(jī)制，為能動(dòng)調(diào)控甘蔗糖分積累提供參考。

4 結(jié)論

從甘蔗中克隆到一個(gè)新的轉(zhuǎn)化酶抑制子基因SoInvInh2，編碼216個(gè)氨基酸，分子量為22.98 kD，等電點(diǎn)為7.8。核苷酸序列GC含量在70%以上，屬于高GC含量基因?；虿缓瑑?nèi)含子序列，其編碼蛋白具有4不對(duì)稱的α-螺旋和4個(gè)保守的Cys位點(diǎn)。49～206 aa是PMEI蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，屬于InvI/PMEI家族成員。植物InvInhs蛋白可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四個(gè)亞家族，SoInvInh2蛋白屬于Ⅰ亞家族。SoInvInh2基因具有組織表達(dá)特異性，但在甘蔗不同生育期葉和莖中的基因表達(dá)模式無明顯規(guī)律。