高 日， 岳園園， 徐亞男， 任鏝蓉， 廉美蘭， 趙 麗

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院;2.延邊林業(yè)科學(xué)研究院:吉林 延吉 133000)

黃檗為蕓香科(Rutaeeae)黃檗屬(PhellodendronamurenseRupr.)植物，別名黃柏、黃菠蘿等，主要分布于遼寧、吉林和黑龍江等地區(qū)。黃檗韌皮部主要含有小檗堿、黃檗堿和木蘭堿等有效成分，具有清熱燥濕和解毒療瘡等功效[1]；黃檗直立高大，木質(zhì)輕，硬度大，紋理較好，是良好的木材。此外，黃檗外皮軟而有彈性，9月份葉片呈黃色，是良好的觀(guān)賞樹(shù)木。由于黃檗具有重要的經(jīng)濟(jì)、藥用和觀(guān)賞價(jià)值，人類(lèi)進(jìn)行大量的采挖或剝皮，野生黃檗資源急劇減少，l987年《中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物名錄》(第一冊(cè))將黃檗定為瀕危種[2]。

組織培養(yǎng)技術(shù)常用于瀕危植物的快速繁殖。目前，黃檗也有一些組織培養(yǎng)的研究報(bào)道，亓磊和詹亞光等[3]研究了培養(yǎng)基條件和接種量、培養(yǎng)時(shí)間及繼代次數(shù)對(duì)黃檗愈傷組織生長(zhǎng)的影響；張玉紅等[4]以黃檗帶頂芽和腋芽的莖段為材料,研究了培養(yǎng)條件對(duì)黃檗組培苗快繁的影響。金玲玲等[5]進(jìn)行了黃柏試管苗生根研究，發(fā)現(xiàn)生根率達(dá)到85.1%，然而在馴化移栽過(guò)程中有大部分試管苗因不適應(yīng)外界環(huán)境而死亡。瓶外生根可以大大提高移栽成活率，瓶外生根技術(shù)是將生根和馴化2個(gè)階段結(jié)合起來(lái)，縮短了育苗周期，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率[6]。為此，本研究進(jìn)行了水培生根研究，探明了營(yíng)養(yǎng)液中IBA濃度和EC對(duì)瓶外生根和幼苗生長(zhǎng)的影響，同時(shí)觀(guān)察了氣孔的變化，為建立黃檗工廠(chǎng)化育苗體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

層積處理后的種子沖洗干凈，在70%的酒精中浸泡30 s，用2%次氯酸鈉溶液浸泡20 min，用無(wú)菌水沖洗5～6次后接種于MS培養(yǎng)基中。培養(yǎng)至種子發(fā)芽后，將幼苗切下接種于MS +BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。將增殖的試管苗切成單株(株高約2 cm)做為試驗(yàn)的材料。

1.2 方法

1.2.1 水培裝置

在長(zhǎng)方形容器(長(zhǎng)×寬×高=26 cm×19 cm×7 cm)中倒入2 L營(yíng)養(yǎng)液(表1)，并在容器底部放入孔隙為60 μm的多孔噴頭，在營(yíng)養(yǎng)液上放入劃有9個(gè)“十”字刀口的泡沫板(長(zhǎng)×寬×厚=25 cm×18 cm×0.3 cm)，泡沫板自然漂浮于營(yíng)養(yǎng)液上。

1.2.2 IBA濃度對(duì)黃檗試管苗水培生根及生長(zhǎng)的影響

在營(yíng)養(yǎng)液(EC=1 mS/cm)中加入不同濃度的IBA(2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L)，營(yíng)養(yǎng)液pH值調(diào)節(jié)為6.0。營(yíng)養(yǎng)液配方如表1。將黃檗試管苗插入容器內(nèi)泡沫板的9個(gè)切口中，通入氣體0.05 vvm (air volume/culture volume/min)，用塑料薄膜覆蓋保濕。培養(yǎng)10 d后，移去塑料薄膜，30 d后調(diào)查幼苗生根及生長(zhǎng)狀況。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1 600 lx，溫度(25±2) ℃，每天光照16 h。

表1 營(yíng)養(yǎng)液配方

1.2.3 營(yíng)養(yǎng)液中EC對(duì)黃檗試管苗水培生根及生長(zhǎng)的影響

將營(yíng)養(yǎng)液的EC分別調(diào)節(jié)為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mS/cm，加入IBA 3.0 mg/L，pH值調(diào)節(jié)為6.0后加入到容器中。每個(gè)容器中栽入9個(gè)試管苗，通氣量調(diào)節(jié)為0.05 vvm。每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)條件和方法同1.2.2。30 d后調(diào)查幼苗生根和生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 黃檗試管苗水培瓶外生根過(guò)程中葉片氣孔變化

容器中加入含3.0 mg/L IBA的營(yíng)養(yǎng)液(EC 1.5 mS/cm，pH值6.0)。將2 cm高的9株黃檗試管苗栽入容器中后，通入氣體0.05 vvm。培養(yǎng)條件和方法同1.2.2，在栽苗后第2、4、6、8和10天的15:00～16:00時(shí)取苗頂部第2葉片。將透明的指甲油涂抹在葉片背面，干燥后，用鑷子將指甲油層取下，放在載玻片上，在光學(xué)顯微鏡400倍下觀(guān)察，利用Olympus顯微圖像分析儀(CX31，日本)調(diào)查氣孔大小和氣孔關(guān)閉率。每葉測(cè)3個(gè)區(qū)，每區(qū)調(diào)查4個(gè)氣孔，取平均值。氣孔關(guān)閉率/%=關(guān)閉氣孔數(shù)/觀(guān)察氣孔總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法作顯著性差異分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBA濃度對(duì)黃檗幼苗生根和生長(zhǎng)的影響

由表2可知，將株高2 cm左右的黃檗試管苗栽植于含有不同濃度IBA的營(yíng)養(yǎng)液中，7 d后發(fā)現(xiàn)莖尖小葉開(kāi)始展開(kāi)，10 d后莖基部開(kāi)始膨大并長(zhǎng)出根。培養(yǎng)30 d后調(diào)查幼苗生根及生長(zhǎng)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)幼苗在IBA 3 mg/L時(shí)，成活率最高，達(dá)到88.7%，同時(shí)幼苗株高、地上部鮮物重和干物重也達(dá)到最大值，分別為13.4，870.0和67.3 mg(表2)；IBA濃度高于3 mg/L時(shí)，幼苗生長(zhǎng)受到限制，株高及生物量減少。對(duì)于地下部，生根率在3和4 mg/L的IBA處理中較高，高于86%以上，根長(zhǎng)，根鮮物重和干物重也在3和4 mg/L IBA處理中最佳。綜合考慮，在營(yíng)養(yǎng)液中加入IBA 3 mg/L較為適宜黃檗試管苗水培生根。

表2營(yíng)養(yǎng)液中IBA濃度對(duì)黃檗幼苗生根和生長(zhǎng)的影響

Table2EffectofIBAconcentrationinnutrientsolutiononrootingandplantletgrowthofPhellodendronemurense

IBA濃度(mg/L)成活率/%地上部株高/cm鮮物重/mg干物重/mg生根率/%地下部根長(zhǎng)/cm鮮物重/mg干物重/mg255.4 9.6 b596.6 b53.2 b43.83.4 b7.2 b1.9 a388.713.4 a870.0 a67.3 a87.25.4 a8.3 a1.8 a465.7 9.2 b610.0 b58.2 b86.24.9 a8.2 a 1.6 ab552.37.4 c576.7 b56.2 b56.23.9 b5.3 c1.3 b

注：表中數(shù)據(jù)為0.05顯著水平的多重比較結(jié)果,下同。

2.2 營(yíng)養(yǎng)液EC對(duì)黃檗生根和幼苗生長(zhǎng)的影響

由表3可知，營(yíng)養(yǎng)液EC對(duì)黃檗幼苗生根有很大影響，幼苗成活率，株高，地上部鮮物重和干物重，生根率和根長(zhǎng)隨EC值的升高而增加，當(dāng)EC值為1.5 mg/L時(shí)，成活率，株高，地上部鮮物重和干物重，生根率和根長(zhǎng)分別達(dá)到92.3%，14.2 cm，943.5 mg，89.37 mg，90.3%，6.1 cm，均為最高值。當(dāng)EC值繼續(xù)增加時(shí)，地上部和地下部生長(zhǎng)勢(shì)，以及生根率都開(kāi)始下降。適合黃檗幼苗生長(zhǎng)EC值為1.5 mS/cm，此時(shí)成活率和生根率達(dá)到最高。

表3營(yíng)養(yǎng)液EC對(duì)黃檗試管苗水培瓶外生根和幼苗生長(zhǎng)的影響

Table3EffectofECinnutrientsolutiononrootingandplantletgrowthofPhellodendronemurense

EC成活率/%地上部株高/cm鮮物重/mg干物重/mg生根率/%地下部根長(zhǎng)/cm鮮物重/mg干物重/mg0.570.29.6 d621.2 d61.2 d82.43.3 d7.1 c1.9 d1.087.511.4 c752.9 c72.5 c86.74.3 c7.7 b 2.1 bd1.592.314.2 a943.5 a89.4 a90.36.1 a8.7 a2.5 a2.087.613.4 b870.2 b80.4 b88.65.5 b8.4 a 2.3 ab2.584.211.5 c723.8 c70.1 c72.54.6 c 7.5 bc 2.0 bd

2.3 水培生根過(guò)程中氣孔變化

觀(guān)察黃檗水培生根過(guò)程中幼苗的葉片氣孔，發(fā)現(xiàn)氣孔長(zhǎng)度在幼苗栽植后0～6 d無(wú)變化，到第8天時(shí)氣孔長(zhǎng)度明顯增大，以后則不隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大(表4，圖1)。氣孔寬度在栽植后第4天起明顯變小，4～10 d變化不大。氣孔寬度和長(zhǎng)度比值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈下降的趨勢(shì)，到第6天時(shí)寬度與長(zhǎng)度比為0.7，以后則沒(méi)有變化。這表明6 d以后，接近圓形的氣孔逐漸拉長(zhǎng)，趨于關(guān)閉狀態(tài)。從氣孔開(kāi)度也可見(jiàn)，0 d時(shí)開(kāi)度最大(11.1 μm)，8 d時(shí)明顯變小，而10 d氣孔開(kāi)度沒(méi)有變化。保衛(wèi)細(xì)胞的寬度在0～4 d無(wú)變化，第6天起則變小。

表4 黃檗試管苗水培瓶外生根時(shí)葉片氣孔大小的變化

注：表中數(shù)據(jù)為0.05顯著水平的多重比較結(jié)果

數(shù)字代表天數(shù)；標(biāo)尺為10 m

調(diào)查氣孔關(guān)閉率，發(fā)現(xiàn)氣孔在培養(yǎng)后的2 d內(nèi)處于張開(kāi)狀態(tài)，從第4天開(kāi)始有19%的氣孔關(guān)閉，而第8天后氣孔關(guān)閉率超過(guò)80%(圖2)。這表明從第8天開(kāi)始，氣孔恢復(fù)關(guān)閉能力。試管苗的氣孔處于張開(kāi)狀態(tài)，失去閉合功能。因此，試管苗出瓶后為避免幼苗失水過(guò)多而死亡，通常采用覆膜保濕措施，氣孔恢復(fù)關(guān)閉功能后撤除保濕薄膜。黃檗試管苗在水培的第8天起葉片氣孔恢復(fù)關(guān)閉能力，可進(jìn)行水分代謝及光合作用，因此，栽植后第8天為黃檗試管苗水培生根培養(yǎng)時(shí)掀去薄膜的適宜時(shí)間。

圖2 黃檗試管苗水培瓶外生根過(guò)程中葉片氣孔關(guān)閉率變化

3 討論與結(jié)論

試管苗瓶外生根技術(shù)是近幾年被廣泛應(yīng)用的組培生根的方法，該技術(shù)主要是將試管苗生根階段和馴化階段結(jié)合起來(lái)，降低瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)時(shí)所需糖以及瓊脂等成本，縮短培養(yǎng)周期，提高移栽成活率，適合工廠(chǎng)化育苗[6-7]。植物在生根培養(yǎng)中，需要選擇適合的激素種類(lèi)和濃度[8]，通常選用IBA、NAA等，黃檗在瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)中IBA效果優(yōu)于NAA[9]。金玲玲[5]研究報(bào)道，黃檗試管苗在IBA濃度為2.0 mg/L時(shí)，瓶?jī)?nèi)生根率較高，本研究發(fā)現(xiàn)IBA濃度為3 mg/L時(shí)，黃檗試管苗水培瓶外生根率達(dá)到86%以上，且水培生根苗生長(zhǎng)健壯，根系發(fā)達(dá)，這可能是因營(yíng)養(yǎng)液中無(wú)蔗糖，幼苗進(jìn)行光合作用所致，這種結(jié)果與Wang等[10]在滿(mǎn)天星瓶外生根培養(yǎng)的結(jié)果相似。電導(dǎo)率是衡量營(yíng)養(yǎng)液中的離子濃度高低的指標(biāo)，培養(yǎng)液電導(dǎo)率的高低對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、品質(zhì)和產(chǎn)量有重要的影響[11-12]。在試管苗水培生根過(guò)程中，不同植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)液EC的要求不同。曹天旭等[13]發(fā)現(xiàn)EC 2.5 mS/cm適合黑莓水培瓶外生根；趙長(zhǎng)新等[14]認(rèn)為，EC 1.0 mS/cm適合梔子瓶外生根；而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃檗試管苗瓶外生根培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)液中EC為1.5 mS/cm時(shí)，幼苗地上部和地下部生長(zhǎng)良好。瓶?jī)?nèi)試管苗氣孔長(zhǎng)期處于張開(kāi)狀態(tài)，試管苗移栽前需要進(jìn)行煉苗，煉苗過(guò)程氣孔逐漸恢復(fù)關(guān)閉能力，具有關(guān)閉氣孔能力的幼苗移栽成活率較高，試管苗瓶外生根也需要進(jìn)行保濕煉苗[15]。植物氣孔通常從6:00—11:00逐漸張開(kāi)，11:00之后開(kāi)始關(guān)閉，16:00后氣孔關(guān)閉逐漸減緩。本試驗(yàn)在16:00觀(guān)察了黃檗試管苗水培生根過(guò)程中氣孔形態(tài)特征以及關(guān)閉數(shù)量，發(fā)現(xiàn)第8天后氣孔關(guān)閉率達(dá)到82%。菜用大黃(RheumrhaponticumL.)試管苗第7天氣孔關(guān)閉率達(dá)到76.5%[16]；無(wú)花果試管內(nèi)生根煉苗第6天，氣孔關(guān)閉率達(dá)到71%[17]，這些結(jié)果與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。