文海若郭雅娟 # 黃芝瑛王 雪 * 淡 墨*

（1．中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心，藥物非臨床安全評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176；2．中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

納米技術(shù)是21世紀(jì)最重要的科學(xué)技術(shù)成果之一，納米材料獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)及其與生物體的相互作用為其應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域提供了廣闊的前景。1995年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了第1個(gè)納米藥物Doxil上市[1]，緊接著在1996年美國(guó)FDA又先后批準(zhǔn)了兩種靜注磁性氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticle，IONP)，分別為Ferumoxil和Ferumoxide，用于肝損傷和腫瘤的核磁共振造影(MRI)診斷[2-3]。IONP是常見(jiàn)的生物醫(yī)用納米材料，其生物相容性較好，且在診斷和殺傷神經(jīng)膠質(zhì)瘤方面效果尤為卓越[4-5]。然而不同表面修飾可導(dǎo)致納米材料與細(xì)胞的相互作用產(chǎn)生明顯差異，從而可能影響其體內(nèi)成像效果和抗腫瘤療效。

肺臟是人體納米材料暴露的主要器官之一，文獻(xiàn)中已有納米氧化鐵致肺臟損傷的報(bào)道。II型肺泡上皮細(xì)胞是肺臟功能單位肺泡的重要組成部分，人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞與II型肺泡上皮細(xì)胞具有相似的生理功能，可通過(guò)內(nèi)吞作用吞噬納米顆粒，且是肺臟毒性的常用體外評(píng)價(jià)模型[6-7]。

胺基(Amine)和聚乙二醇[poly(ethyleneglycol)，PEG]是常見(jiàn)的納米材料表面修飾基團(tuán)，可賦予納米顆粒不同的表面電荷及細(xì)胞作用特征。前者攜帶正電荷，與帶有負(fù)電荷的PEG相比，經(jīng)胺基修飾的納米材料更易于與表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞相互作用。本研究首先通過(guò)比較相同粒徑范圍(約5 nm)的胺基表面修飾的納米氧化鐵顆粒(Amine-IONP)和聚乙二醇表面修飾的納米氧化鐵顆粒(PEG-IONP)對(duì)A549細(xì)胞存活率和細(xì)胞周期的影響；之后使用高內(nèi)涵法評(píng)價(jià)經(jīng)不同納米氧化鐵顆粒處理后胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量、線粒體膜電位(mitochondtial membrance potential，MMP)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)狀態(tài) 指標(biāo)的變化；然后采用體外胞質(zhì)分裂法微核試驗(yàn)和堿性彗星電泳評(píng)價(jià)其對(duì)DNA損傷的影響，從而綜合比較不同表面修飾的氧化鐵納米顆粒對(duì)A549細(xì)胞的毒性及其作用機(jī)制的差異。研究聯(lián)合使用氧自由基清除劑乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)和叔丁基對(duì)羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激作用與DNA及染色體斷裂的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要化學(xué)試劑包括：平均粒徑為5 nm的PEGIONP(生產(chǎn)批號(hào)MKBR4497V)和Amine-IONP(生產(chǎn)批號(hào)MKBR2641V)，以及遺傳毒性陽(yáng)性劑絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)和甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate)均購(gòu)自Sigma Aldrich公司；Cell Titer-Glo 2.0試劑盒購(gòu)自Promega公司；PI/RNase染液、乙酰半胱氨酸(NAC) 和叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞核熒光探針Hoechst 33342、胞內(nèi)活性氧檢測(cè)熒光探針DCFH-DA、線粒體膜電位檢測(cè)熒光探針Mito Tracker?Red CMXRos、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平檢測(cè)熒光探針ER-Tracker Red和SYBR Green I nuclei acid gel stain購(gòu)自Life Technologies；Trevigen Comet Assay Kit彗星檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Trevigen公司；anti-p21抗體、anti-p53抗體、anti-β-tubulin抗體購(gòu)自SANTA CRUZ。

主要儀器包括：Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分 析 儀(Malvern)；FACS CaliburTM流 式 細(xì) 胞 儀(BD)；Mini-PROTEAN?Tetra Cell 系 統(tǒng) (BIO-RAD)， SPECTR Amax-PLUS型酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；5810R型離心機(jī)(Eppendorf)；DYCP31F 型電泳儀(北京市六一儀器廠)；Eclipse 80i熒光顯微鏡(Nikon)；Komet 6.0圖像分析系統(tǒng)(Andor Technology)；IN Cell 2 000高內(nèi)涵分析儀(GE Healthcare)。

1.2 細(xì)胞

人肺腺癌II型肺泡基底上皮細(xì)胞A549由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供，液氮中保存。本研究所用細(xì)胞代數(shù)在第90～100代，細(xì)胞倍增時(shí)間約20～24 h，支原體檢測(cè)結(jié)果為陰性。

1.3 氧化鐵納米顆粒的粒徑分布和表面電性測(cè)定

Amine-IONP與PEG-IONP分別經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋到一定濃度后，使用動(dòng)態(tài)光散射法(dynamic light scattering，DLS)檢測(cè)顆粒在細(xì)胞培養(yǎng)液中的顆粒分布和表面帶電性。經(jīng)測(cè)定兩種不同表面修飾的5 nm氧化鐵納米顆粒在細(xì)胞培養(yǎng)液中均勻分布，無(wú)明顯聚集。PEG-IONP顆粒平均分布為(5.6±0.4) nm，表面帶電為-2 mV；Amine-IONP顆粒平均分布為(5.3±0.7)nm，表面帶電為+13 mV[8]。

1.4 細(xì)胞存活率測(cè)定

使用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%熱滅活小牛血清，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)培養(yǎng)A549細(xì)胞，并分別更換無(wú)菌注射用水及不同濃度(20、40、80、160、 320 μg/mL)的 Amine-IONP和 PEG-IONP處 理 48 h，每濃度8個(gè)復(fù)孔。保留孔內(nèi)原培養(yǎng)基，加入等量Cell Titer-Glo?2.0 Reagent，室溫孵育10 min后立即檢測(cè)生物發(fā)光強(qiáng)度。因各濃度條件下細(xì)胞存活抑制率均<20%，整個(gè)研究中Amine-IONP和PEG-IONP均使用上述濃度范圍開(kāi)展。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)不同濃度處理24 h后在4 ℃預(yù)冷的70%乙醇溶液中固定，并在-20 ℃保存過(guò)夜處理。每樣加入500 μL PI/RNase染液室溫避光孵育30 min，并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組分析2×104個(gè)細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)，分析軟件為ModFit LT(Verity Software House)。

1.6 p21和p53蛋白表達(dá)水平測(cè)定

細(xì)胞經(jīng)不同濃度PEG-IONP處理24 h后，經(jīng)裂解液冰浴裂解20 min。細(xì)胞裂解經(jīng)勻漿后備用。樣本經(jīng)BCA試劑盒定量后，每個(gè)樣品取約20 μg總蛋白加至含4%濃縮膠和10%分離膠的SDS-PAGE電泳(濃縮膠50 V恒壓電泳40 min，待樣品進(jìn)入分離膠后，更換電壓至100 V恒壓電泳直至克羅寧、溴酚藍(lán)遷移至凝膠邊緣)，并轉(zhuǎn)至PVDF膜(100 V電泳轉(zhuǎn)移90 min)。轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜放入含5% BSA-TBS中，室溫?fù)u動(dòng)1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合位點(diǎn)。之后將膜用TBS/T洗3次，每次5 min。洗滌完畢后，將膜放入容器中，分別加入稀釋 于 1% BSA-TBS/T中 的 anti-p21(1∶ 200)、 anti-p53(1∶200)和anti-β-tubulin(1∶5 000)抗體，4 ℃置于搖床上，平緩搖動(dòng)過(guò)夜。一抗標(biāo)記后取出膜，用TBS/T洗3次，將膜重新放入容器中，加入5 000倍稀釋于1%BSA-TBS/T中的辣根酶標(biāo)記二抗。室溫平緩搖動(dòng)1 h后，取出膜，用TBS/T洗3次。在膜上加入化學(xué)發(fā)光試劑后在暗室內(nèi)顯色曝光。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 胞內(nèi)ROS含量測(cè)定 細(xì)胞接種及給藥方法同上，每個(gè)試驗(yàn)條件每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔8個(gè)。孵育結(jié)束后棄去孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含Hoechst 33342 (終濃度2.5 μg/mL)和H2DCFDA(終濃度10 μmol/L)的培養(yǎng)基混合液，胞內(nèi)ROS通過(guò)將H2DCFDA去乙?；蛊湓?95 nm激發(fā)光下發(fā)射綠色熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度來(lái)反映胞內(nèi)ROS的含量。

1.7.2 線粒體損傷水平的測(cè)定 每孔加入100 μL含Hoechst 33342(終 濃 度 2.5 μg/mL)和 MitoTracker?Red CMX Ros(終濃度100 nmol/L)的培養(yǎng)基混合液，探針進(jìn)入細(xì)胞后在狀態(tài)正常的線粒體內(nèi)蓄積，固定過(guò)程可以去除膜電勢(shì)下降的居于線粒體中的探針，因此可以根據(jù)熒光探針的數(shù)量來(lái)反映線粒體的狀態(tài)。

1.7.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷水平的測(cè)定 每孔加入100 μL含Hoechst 33342(終濃度2.5 μg/mL)和ER-Tracker Red(終濃度1 μmol/L)的培養(yǎng)基混合液，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面突出表達(dá)磺酰脲受體與ER-Tracker結(jié)合，因此根據(jù)結(jié)合的ERTracker的多少可以反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能狀態(tài)。分別加入上述染料后，細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)30 min，之后移除含染料的培養(yǎng)基，使用PBS 100 μL清洗2次，每孔加入50 μL含5%甲醇的PBS溶液固定，使用IN Cell 2000型高內(nèi)涵系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 彗星試驗(yàn)

彗星試驗(yàn)方法詳見(jiàn)前期研究[9]，簡(jiǎn)述如下。調(diào)整A549細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，更換不同濃度Amine-IONP和PEG-IONP和陽(yáng)性對(duì)照(EMS，200 μg/mL)分別處理48 h，之后收獲細(xì)胞并將密度調(diào)整為2×105/mL。1.5 mL試管37 ℃水浴預(yù)熱，每管預(yù)先加入300 μL Comet LMAgarose(Trevigen Comet Assay Kit彗星檢測(cè)試劑盒中瓊脂糖凝膠制備試劑)。每孔取單細(xì)胞懸液30 μL，用移液頭與預(yù)熱的Comet LMAgarose迅速混合均勻1～2次后鋪片，保證細(xì)胞均勻分布于每孔，每個(gè)樣本平行2孔。鋪片結(jié)束后將玻片置于4 ℃、避光、過(guò)夜裂解。之后將玻片碼放在電泳槽內(nèi)，緩緩添加預(yù)冷的堿性解旋液(pH>13)，室溫、避光解旋20 min。電泳條件為電壓約0.7 V/cm，電流約300 mA，電泳時(shí)間20 min。玻片經(jīng)中和、脫水處理后晾干。

染色時(shí)將稀釋過(guò)的SYBR Green I(1∶10 000)加在每孔表面，4 ℃冰箱放置5 min，室溫、避光晾干。使用Komet 6.0(Andor Technology)彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析。每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)100個(gè)彗星細(xì)胞的尾部DNA百分率(percentage of tail DNA)和Olive尾矩(Olive tail moment)的中位數(shù)。

1.9 胞質(zhì)分裂阻斷法微核試驗(yàn)

A549細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔4×105個(gè)，培養(yǎng)約48 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好并達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期更換不同濃度培養(yǎng)液。在無(wú)代謝活化條件下，給予不同濃度的PEG-IONP和Amine-IONP處理48 h；另設(shè)滅菌注射用水溶媒對(duì)照組和MMC(0.1 μg/mL)陽(yáng)性對(duì)照組處理24 h。每個(gè)處理?xiàng)l件設(shè)3個(gè)復(fù)孔。與細(xì)胞作用約24 h后更換含CytoB(3 μg/mL)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至約24 h。細(xì)胞收獲時(shí)，用胰酶-EDTA液消化細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞懸液移至15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min。用DPBS洗滌2次，加入用預(yù)溫的0.075 mol/L KCl溶液2 mL于 37 ℃低滲處理5 min；加入固定液(甲醇∶冰醋酸體積比為3∶1)5 mL固定，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)固定2次。滴片制備標(biāo)本并編號(hào)。固定后的玻片標(biāo)本浸入5% Giemsa應(yīng)用液中，染色25～30 min；將染色后的標(biāo)本先后置于自來(lái)水、超純水中沖洗干凈，室溫下自然干燥。

顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)每個(gè)劑量組的Giemsa染色玻片標(biāo)本中：每2 000個(gè)雙核細(xì)胞中微核(micronucleus，MN)和核質(zhì)橋(nucleoplasmic bridge，NPB)出現(xiàn)率[10]。

1.10 氧自由基清除劑預(yù)處理

為評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激作用對(duì)細(xì)胞染色體和DNA斷裂的影響，A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度Amine-IONP和PEG-IONP處理前，先給予氧自由基清除劑在BHA(100 μmol/L)或NAC(1 mmol/L)預(yù)處理30 min。之后分別如前開(kāi)展ROS水平測(cè)定、微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)測(cè)定。

1.11 結(jié)果分析

2 結(jié) 果

2.1 氧化鐵納米顆粒對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

320 μg/mL Amine-IONP和PEG-IONP與A549細(xì)胞作用24 h或48 h后，細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯改變且細(xì)胞表面無(wú)明顯的顆粒團(tuán)聚(圖1)。處理濃度為160 μg/mL及以下時(shí)Amine-IONP和PEG-IONP對(duì)細(xì)胞存活率均無(wú)明顯抑制作用。當(dāng)處理濃度達(dá)到320 μg/mL時(shí)，與無(wú)菌注射用水溶媒對(duì)照組比較，僅PEG-IONP處理48 h后的細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01，圖2)。

圖1 A549細(xì)胞分別經(jīng)Amine-IONP和PEG-IONP(320 μg/mL)處理24和48 h后形態(tài)學(xué)觀察示例

2.2 氧化鐵納米顆粒對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

A549細(xì)胞經(jīng)不同受試物處理后，通過(guò)染色細(xì)胞核來(lái)分析其細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均可降低處于S期的細(xì)胞比率(表1)。與對(duì)照組比較，320 μg/mL Amine-IONP處理后S期細(xì)胞比率顯著降低(P<0.01)，而PEGIONP 自20 μg/mL起即明顯減少S期細(xì)胞比率(P<0.01)，且均有濃度相關(guān)趨勢(shì)。提示納米氧化鐵顆粒均可誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，且PEG-IONP可在較低濃度產(chǎn)生細(xì)胞阻滯效應(yīng)。進(jìn)一步對(duì)與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PEG-IONP處理細(xì)胞24 h后可誘導(dǎo)p21與p53表達(dá)水平顯著升高(圖3，P<0.05)。

圖2 A549細(xì)胞與不同濃度Amine-IONP和PEG-IONP分別作用后的細(xì)胞存活率變化

表1 Amine-IONP和PEG-IONP對(duì)A549細(xì)胞周期的影響(n=3)

2.3 氧化鐵納米顆粒潛在的氧化應(yīng)激損傷評(píng)價(jià)

熒光探針標(biāo)定結(jié)合高內(nèi)涵檢測(cè)結(jié)果提示，Amine-IONP作用24 h后即可誘導(dǎo)A549細(xì)胞ROS的過(guò)量生成，且存在濃度效應(yīng)關(guān)系；而PEG-IONP在處理48 h后才誘導(dǎo)細(xì)胞ROS水平顯著升高(圖4)。給藥48 h后，Amine-IONP和PEG-IONP誘導(dǎo)ROS水平顯著升高的起始濃度分別為20和40 μg/mL。此外，分別檢測(cè)不同細(xì)胞線粒體膜電位和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)氧化鐵納米顆粒可對(duì)細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器造成損傷(圖5和圖6)。Amine-IONP誘導(dǎo)MMP和ER損傷水平顯著性改變的起始濃度均低于PEG-IONP，而相同濃度作用條件下，前者誘導(dǎo)的損傷更為顯著。提示相同濃度作用下，Amine-IONP更易于誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激 效應(yīng)。

圖3 PEG-IONP對(duì)A549細(xì)胞p21和p53蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 氧化鐵納米顆粒致DNA斷裂作用

堿性彗星電泳試驗(yàn)通常用于評(píng)價(jià)受試物潛在的細(xì)胞毒性和致DNA斷裂性。不同濃度的兩種氧化鐵納米顆粒與細(xì)胞分別作用48 h后，均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的尾部DNA百分率顯著性升高(P<0.01)(圖7A、B)。在染色體損傷層面，給予納米氧化鐵顆粒48 h后也可誘導(dǎo)A549細(xì)胞微核率顯著升高(圖7C)。相同濃度條件下Amine-IONP 誘導(dǎo)的尾部DNA百分率和微核率均高于PEG-IONP。核質(zhì)橋發(fā)生率整體背景值較低，且僅PEG-IONP在160 μg/mL 以上濃度可顯著誘導(dǎo)核質(zhì)橋發(fā)生率的升高，而Amine-IONP則對(duì)核質(zhì)橋發(fā)生率無(wú)影響(圖7D)。

圖4 Amine-IONP和PEG-IONP作用24或48 h后對(duì)A549細(xì)胞ROS相對(duì)水平的影響

圖5 Amine-IONP和PEG-IONP作用24或48 h后對(duì)A549細(xì)胞MMP相對(duì)水平的影響

為進(jìn)一步確證氧化應(yīng)激作用在IONPs誘導(dǎo)的遺傳物質(zhì)損傷中扮演的角色，分別使用自由基清除劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后再將細(xì)胞與Amine-IONP和PEG-IONP作用48 h。細(xì)胞經(jīng)NAC(1 mmol/L)或BHA(100 μmol/L)預(yù)處理后均可顯著抑制Amine-IONP和PEG-IONP所誘導(dǎo)的ROS水平、尾部DNA百分率和微核百分率的升高(見(jiàn)圖8)。

3 討 論

IONP是常見(jiàn)的生物醫(yī)用納米材料，已有相關(guān)產(chǎn)品(如Ferumoxil和Ferumoxide)在臨床用于臨床醫(yī)學(xué)造影診斷[2-3]。與其他含金屬粒子的納米材料比較，IONP的毒性較低但具有多種表面修飾，有助于我們研究納米顆粒表面修飾對(duì)其毒性的影響。本研究從細(xì)胞存活率、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激和DNA斷裂等多角度，對(duì)粒徑接近而表面修飾不同的兩種IONPs (Fe3O4NP)的潛在細(xì)胞毒性進(jìn)行了比較。Amine-IONP更易于誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞內(nèi)自由基蓄積是兩種IONPs造成DNA損傷的主要原因；而PEG-IONP除氧化應(yīng)激損傷外，與Amine-IONP相比較更易于抑制細(xì)胞增殖，PEG誘導(dǎo)的DNA損傷較弱可能與其細(xì)胞周期阻滯作用有關(guān)。

圖6 Amine-IONP和PEG-IONP作用24或48 h后對(duì)A549細(xì)胞ER相對(duì)水平的影響

圖7 Amine-IONP和PEG-IONP處理后A549細(xì)胞的彗星試驗(yàn)和微核試驗(yàn)結(jié)果

金屬納米顆粒在應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域前，通常需要通過(guò)不同分子對(duì)其進(jìn)行表面修飾從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性與生物相容性。常用的納米氧化鐵顆粒表面修飾材料包括聚乙烯-乙酸乙烯酯[poly(ethylene-co-vinyl acetate)]、聚乙烯吡咯烷酮[poly(vinylpyrrolidone)，PVP]、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]、PEG等[11]。然而不同表面修飾可對(duì)其毒性產(chǎn)生一定影響，如IONP (Fe3O4NP)經(jīng)PLGA包被后，與未經(jīng)包被的顆粒對(duì)比，其DsRed-Rab7細(xì)胞攝取量有所下降且對(duì)細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的損傷程度顯著減輕，該結(jié)果也在NIH小鼠重復(fù)給藥試驗(yàn)中得到驗(yàn)證[12]。Malvindi等[13]發(fā)現(xiàn)含有二氧化硅外殼的IONP對(duì)A549和HeLa細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用和細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)損傷均明顯減輕。某些表面修飾可通過(guò)減毒有助于其生物應(yīng)用。如表面經(jīng)亞硝酸鈉硝基化的IONP與人外周血淋巴細(xì)胞在體外條件下作用24 h后彗星試驗(yàn)結(jié)果為陰性，提示其可作為釋放一氧化氮的納米攜帶者在體內(nèi)發(fā)揮抗炎功效[14]。而某些表面修飾則可增加納米顆粒的毒性，如與無(wú)包被的IONP(Fe3O4NP)相比，油酸鈉(sodium oleate)包被的IONP(Fe3O4NP)對(duì)Balb/3T3和COS-1的細(xì)胞毒性較大[15]。本研究對(duì)比了兩種不同表面修飾且攜帶不同電荷的IONPs，結(jié)果顯示Amine-IONP和PEG-IONP均可引起A549細(xì)胞總ROS水平升高以及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷，且Amine-IONP誘導(dǎo)氧化應(yīng)激效應(yīng)的能力要強(qiáng)于PEGIONP。攜帶正電荷的顆?？赡芨子诒槐砻鎺ж?fù)電荷的細(xì)胞攝取，考慮帶正電荷的Amine-IONP表現(xiàn)出的更為顯著的氧化應(yīng)激作用和DNA斷裂效應(yīng)可能與其細(xì)胞攝取水平較高有關(guān)[16]。

圖8 NAC和BHA預(yù)處理對(duì)IONPs誘導(dǎo)的ROS水平、彗星拖尾和微核率的影響

大量研究提示IONP可誘導(dǎo)氧化損傷和DNA損傷，前者是后者的主要作用機(jī)制之一，也是IONP在人體殺傷腫瘤細(xì)胞和毒性作用的主要機(jī)制[17]。粒徑約30~35 nm的IONPs(Fe2O3NP)可誘導(dǎo)大鼠外周血抗氧化酶出現(xiàn)顯著抑制[18]；粒徑約5 nm的IONP可誘導(dǎo)小鼠心肌氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物如ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)和超氧化物歧化酶等水平顯著升高，并造成心肌組織DNA損傷(彗星試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性)[19]。在體外研究中，10 μg/mL IONP(Fe2O3NP，<50 nm)即可誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的ROS、GSH、LPO、超氧化物歧化酶等指標(biāo)和尾部DNA百分率顯著性升高[20]。 K?ncz?l等[6]研究提示粒徑約20~60 nm的IONP與A549細(xì)胞接觸24 h后可通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，電鏡下每個(gè)細(xì)胞含有約幾十至幾百個(gè)顆粒，在約1/100的細(xì)胞中可見(jiàn)顆粒位于細(xì)胞核。該IONP 可誘導(dǎo)微核率和尾部DNA百分率升高，但在自由基清除劑存在的情況下遺傳毒性嚴(yán)重程度可顯著性降低。此外，IONP(Fe3O4NP)也通過(guò)氧化應(yīng)激作用誘導(dǎo)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)損傷[21]。上述文獻(xiàn)結(jié)果與課題組前期研究[8]和本研究中發(fā)現(xiàn)的IONP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激效應(yīng)和遺傳物質(zhì)損傷結(jié)果基本相符。

納米材料普遍可對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用。如納米銀可誘導(dǎo)敘利亞倉(cāng)鼠胚胎細(xì)胞發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯[22]，而IONP可通過(guò)影響細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)水平而誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞比例下調(diào)[23]。此外，納米材料還可破壞人神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，從而干預(yù)神經(jīng)形成穩(wěn)定性來(lái)干預(yù)有絲分裂的正常進(jìn)行[24]。本研究中觀察到PEG-IONP在較低濃度條件下(20 μg/mL)就可產(chǎn)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)，且與相同濃度的Amine-IONP相比抑制效應(yīng)更為顯著，并可誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖有關(guān)的蛋白質(zhì)p21和p53的表達(dá)量上調(diào)。PEG-IONP對(duì)A549細(xì)胞周期抑制作用是其最主要的毒性表現(xiàn)，與其誘導(dǎo)的NBP百分率升高有關(guān)。NBP百分率的顯著性升高提示PEG-IONP可能通過(guò)抑制細(xì)胞周期進(jìn)一步干預(yù)了處于G0/G1期的細(xì)胞中染色體附著于著絲粒的過(guò)程，從而形成細(xì)胞核分離不完全的雙核細(xì)胞結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果可通過(guò)識(shí)別著絲粒的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)法微核試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證[25]。

綜上所述，納米顆粒的表面修飾、表面電荷分布等特性可使其細(xì)胞/組織攝取機(jī)制、毒性機(jī)制及毒性表現(xiàn)存在一定差異。就IONP而言，PEG表面修飾產(chǎn)生的細(xì)胞毒性和遺傳毒性較低，但PEG-IONP作為異物進(jìn)入細(xì)胞后更易于干擾細(xì)胞增殖，作為腫瘤診斷試劑具有一定優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果為設(shè)計(jì)合理的納米材料表面修飾結(jié)構(gòu)，提高生物醫(yī)用納米材料的療效及減毒，進(jìn)而推動(dòng)納米材料產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了數(shù)據(jù)支持。