曹劍鋒， 劉其高， 蔣小飛， 周進(jìn)康， 歐岳姣， 徐連巧

(1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550018； 2.貴州師范學(xué)院藥用植物生物技術(shù)研究所，貴州貴陽 550018)

陰地蕨[Botrychiumternatum(Thunb) Sw.]為陰地蕨科陰地蕨屬植物，別稱一朵云、小春花、四塊瓦等[1]，具有清熱解毒、平肝熄風(fēng)、止咳、止血、明目去翳等作用[2]，藥用價(jià)值高?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，陰地蕨具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力[3]、祛痰[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、改善肝功能以及阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化等功效[7]。對(duì)陰地蕨成分的研究表明，陰地蕨含有豐富的黃酮類化合物[8]。黃酮類物質(zhì)因具有活性高、作用廣泛等特點(diǎn)而被用于醫(yī)藥、保健食品及化妝品等領(lǐng)域[9-11]。因此，本試驗(yàn)采用超聲波輔助法提取陰地蕨根中的總黃酮，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)化確定最佳提取工藝，對(duì)總黃酮抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為陰地蕨根黃酮的藥理效用研究及天然的抗氧化劑開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以陰地蕨根為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)所用試劑包括蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技公司)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、水楊酸、硫酸亞鐵(FeSO4)、過氧化氫(H2O2)、三羥基氨基甲烷、鄰苯三酚、鹽酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵(國(guó)藥化學(xué)基團(tuán)有限公司)等為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200E型超聲波清洗器、FW135粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；722分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；80-2B型離心機(jī)(江蘇正基儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA-N-1100，東京理化器械株式會(huì)社)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用硝酸鋁絡(luò)合紫外分光光度法，以蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過測(cè)定不同質(zhì)量濃度蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品在510 nm處的吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=10.53x+0.008，其中，y表示測(cè)試樣品液在510 nm處的吸光度，x表示樣品液的濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線適用范圍為0～100 μg/mL[12]。

1.3.2 陰地蕨根總黃酮提取及含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取陰地蕨根干粉末0.08 g，并將其置于10 mL離心管中，按一定料液比(g ∶mL)添加乙醇溶液，采用一定功率超聲波在一定時(shí)間內(nèi)提取總黃酮。提取液在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心 5 min，濾渣以同樣條件提取、離心、合并上清液，然后用乙醇溶液定容至25 mL。取定容好的樣品2 mL進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)水平的試驗(yàn)在相同條件下提取3個(gè)平行樣[13-14]。

用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定陰地蕨根提取液中總黃酮的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算提取液總黃酮的質(zhì)量濃度，根據(jù)公式(1)計(jì)算總黃酮提取率。

(1)

表1 正交試驗(yàn)的因素水平

1.3.4 提取物體外抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.4.1 清除·OH能力的測(cè)定 參考樊琛等的方法[15]測(cè)定提取物對(duì)·OH的清除能力。向帶塞10 mL試管中依次加入 1 mL樣品溶液、2 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 1.8 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和2 mL 1.96 mmol/L H2O2溶液。以蒸餾水代替樣品液做空白對(duì)照，設(shè)其在510 nm處的吸光度為D0，樣品溶液的吸光度為Dx，不加顯色劑H2O2時(shí)的蒸餾水對(duì)照組吸光值為D1；整個(gè)反應(yīng)時(shí)間為30 min，平行測(cè)定3次。根據(jù)公式(2)計(jì)算·OH清除率：

K1=[D0-(Dx-D1)]/D0×100%。

(2)

K2=(D0-D1)/D0×100%

(3)

1.3.4.3 清除DPPH·能力的測(cè)定 參照李波等的方法[17]測(cè)定提取物對(duì)DPPH·的清除能力。將DPPH用無水乙醇配制成0.2 mmol/L的溶液，分別吸取2.0 mL的樣品溶液和 2.0 mL 的DPPH溶液，避光混勻，反應(yīng)30 min后，于 517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值D1；另取2.0 mL不同質(zhì)量濃度總黃酮乙醇溶液，加入2.0 mL無水乙醇混合均勻后測(cè)定吸光度D2；測(cè)定2.0 mL蒸餾水加入2.0 mL DPPH(1 mmol/L)溶液后的吸光度D0。根據(jù)公式(4)計(jì)算DPPH·清除率：

K3=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

(4)

1.3.4.4 總還原力的測(cè)定 參照董蘭芳等的方法[18]測(cè)定提取物的總還原力。取2.0 mL樣品溶液，加入2.5 mL磷酸緩沖液(濃度為0.2 mol/L，pH值為6.6)和2.5 mL 1%鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]溶液。將此混合物在50 ℃條件下放置 20 min 后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，然后離心10 min，吸取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，均勻混合后在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度D1。用蒸餾水做空白對(duì)照，在同樣的條件下測(cè)定其吸光度D0，平行測(cè)定3次。按公式(5)計(jì)算提取物的總還原力：

K=(D1-D0)/D1×100%。

(5)

2 結(jié)果與分析

2.1 陰地蕨根總黃酮提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)黃酮提取率的影響 由圖1可知，當(dāng)料液比低于1 g ∶60 mL時(shí)，隨著料液比的增大，總黃酮提取率增加，當(dāng)料液比為1 g ∶60 mL時(shí)，提取率達(dá)到最大值，而當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)提取率降低。

2.1.2 溫度對(duì)黃酮提取率的影響 由圖2可知，在溫度低于60 ℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，黃酮提取率整體呈增大趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，提取率增加到最大值，而且當(dāng)溫度再升高時(shí)，提取率不再增加。說明升高溫度有利于黃酮類物質(zhì)的溶出，但溫度升高到一定程度時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致一些黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)被氧化破壞，從而導(dǎo)致總黃酮提取率降低[19]。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，陰地蕨根的總黃酮提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，提取率增加到最大值，而隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，提取率減小?？赡艿脑蚴且徊糠贮S酮類物質(zhì)被超聲波分解，導(dǎo)致總黃酮提取率下降[20-21]。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響 由圖4可知，乙醇濃度過低，不利于陰地蕨根的總黃酮提取，低濃度乙醇條件下，黃酮的提取率較低，隨著乙醇濃度的提高，提取率先增大后減小，當(dāng)乙醇濃度超過80%時(shí)，提取率隨著乙醇濃度的增大而降低。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增多，陰地蕨根總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)提取次數(shù)≥2次時(shí)，提取率的增長(zhǎng)量較少。

2.2 正交試驗(yàn)與抗氧化活性分析

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 由表2可知，4種因素對(duì)提取效果的影響與“2.1”節(jié)的單因素試驗(yàn)結(jié)果基本相同，各因素水平之間的極差大小依次為C>A>B>D，因此影響陰地蕨根總黃酮提取率的因素主次順序表現(xiàn)為乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間>提取溫度。由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，最佳提取工藝為C3A3D3B1，即乙醇濃度為90%，料液比為1 g ∶70 mL，溫度為 60 ℃，提取時(shí)間為40 min。

2.2.2 清除·OH正交試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，各試驗(yàn)組黃酮提取物對(duì) ·OH 的清除作用差異較大，4種因素對(duì)黃酮提取物清除羥基自由基能力的影響表現(xiàn)為C>D>B>A，最佳試驗(yàn)條件為C1D1B2A3，即乙醇濃度為70%，提取溫度為 40 ℃，提取時(shí)間為50 min，料液比為1 g ∶70 mL。

2.2.3 清除DPPH·正交試驗(yàn)結(jié)果 由表4可知，各試驗(yàn)組黃酮提取物對(duì)DPPH·都有一定的清除作用，且4種因素對(duì)黃酮提取物清除羥基自由基能力的影響表現(xiàn)為D>A>C>B，且最佳試驗(yàn)條件為D3A2C2B1，即提取溫度為60 ℃，料液比為 1 g ∶60 mL，乙醇濃度為80%，提取時(shí)間為40 min。

表2 提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 清除·OH正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 清除DPPH·正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 清除正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 總還原力正交試驗(yàn)結(jié)果 由表6可知，黃酮提取物的總還原力較強(qiáng)，且4種因素對(duì)黃酮提取物還原能力的影響表現(xiàn)為A>D>B>C，最佳試驗(yàn)條件為A3D3B1C3，即料液比為 1 g ∶70 mL，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為40 min，乙醇濃度為90%。

表6 總還原力正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)優(yōu)化陰地蕨根中總黃酮提取工藝條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，影響陰地蕨根總黃酮提取率的因素主次順序依次為乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間>提取溫度；優(yōu)化后的提取工藝條件為乙醇濃度90%，料液比1 g ∶70 mL，溫度60 ℃，時(shí)間40 min。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究開發(fā)利用陰地蕨奠定了基礎(chǔ)。