段寧振，張 寧，李夢園，王瀑童，常亞南，袁曉波，樊亞棟，李永春，孟凡榮

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002)

小麥?zhǔn)俏覈钪饕募Z食作物之一，其產(chǎn)量多少直接影響我國的糧食安全和社會穩(wěn)定[1-2]。干旱、高鹽等逆境脅迫是影響作物高產(chǎn)的主要限制因素。植物受到逆境脅迫誘導(dǎo)后會產(chǎn)生一系列調(diào)控蛋白，并通過對基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及生理過程的調(diào)控增強植株對逆境脅迫的耐受性[3]。LEA(late embryogenesis abundant proteins)是一類受水分脅迫誘導(dǎo)而大量表達(dá)的功能蛋白，其在植物適應(yīng)逆境的過程中發(fā)揮非常重要的調(diào)控功能[4-6]。

脫水素(dehydrins,DHN)是LEA蛋白家族的重要成員之一，屬于LEA的D-Ⅱ家族，蛋白分子量大小在9 kDa到200 kDa之間[7]；脫水素具有較強的親水性，大量表達(dá)的脫水素能夠束縛水分子，維持細(xì)胞液正常流動，從而具有保持細(xì)胞穩(wěn)定的功能[8-9],在逆境脅迫條件下能夠起到維持細(xì)胞滲透平衡、替代水分子與細(xì)胞膜結(jié)合、增強膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等多種調(diào)節(jié)作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，脫水素在擬南芥、水稻、玉米、小麥等多種植物中廣泛存在。擬南芥脫水素AtHIRD11能夠通過與Cu2+結(jié)合，降低活性氧的生成，從而降低自由基的產(chǎn)生和過氧化毒害[12]。擬南芥脫水素COR15a對低溫脅迫比較敏感，能夠通過減弱底物的聚集而對酶的活性起到一定的保護作用[13-14]。大麥中的脫水素HvDHN5在干旱、低溫、鹽等逆境脅迫條件下均被誘導(dǎo)表達(dá)[15]。在小麥中，脫水素也是受水分脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，例如TaDHN-1、WDHN-1和WCOR410均為受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的脫水素，其可能通過依賴于ABA的信號通路在逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要功能[16-17]；小麥WDHN1-2主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。目前，關(guān)于小麥中脫水素參與的逆境脅迫分子調(diào)控機制仍不十分清楚。

本課題組在前期研究中系統(tǒng)分析了小麥根系水分脅迫響應(yīng)的基因差異表達(dá)譜[19]，并鑒定出一個在水分脅迫過程中被大量誘導(dǎo)表達(dá)的脫水素基因(TaAffx.131747.1.S1_x_at)。在此基礎(chǔ)上，本研究擬克隆該脫水素基因，并系統(tǒng)分析其序列特征及生物學(xué)功能，以期為該基因進一步應(yīng)用于小麥抗逆分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

選用洛旱2號和中國春作為試驗材料。在恒溫光照培養(yǎng)箱中，采用水培法育苗(26 ℃，光照16 h/8 h)，幼苗培養(yǎng)至兩葉一心時分別進行干旱處理[20% PEG6000(w/v)]、鹽脅迫處理[NaCl濃度為100 mmol·L-1]和ABA處理(濃度為100 μmol·L-1)，取材時間為處理0 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h。所有材料經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株、載體試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5 、BL21購于大連TaKaRa公司。載體pMD19-T(TaKaRa,中國大連)，pET-28a為本實驗室保存。TransZol Plant，熒光染料購于TransGen Biotech公司(北京)，In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，La Taq、EcoR I、XhoI購于TaKaRa公司(中國大連)，質(zhì)粒提取試劑盒、HRP-DAB試劑盒購自天根生化科技(北京)，HIS抗體購于Abcam公司(上海)，山羊抗兔IgG二抗, HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記購于康為世紀(jì)。

1.3 RNA和gDNA提取

使用Trizol(Invitrotgen)法[20]提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測RNA質(zhì)量，利用Nanodrop2000核酸分析儀測定總RNA的濃度和純度?；蚪MDNA提取采用CTAB法。

1.4 小麥 TaDHN-2>基因的克隆和序列分析

根據(jù)課題組的前期研究結(jié)果[19]，進行NCBI的序列比對和生物信息學(xué)分析，依據(jù)分析結(jié)果設(shè)計了特異性引物TaDHN-2-1(5′-CAAGTGAGCAAGACAACACACCATA-3′)和TaDHN-2-2(5′-CACCTCAAACTTTCACAAGTAGCGG-3′)用于cDNA片段的克隆，PCR擴增結(jié)果經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行DNA片段凝膠回收、純化，并連接到pMD19-T載體進行測序分析。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析采用CSOPMA, CCD、Expasy在網(wǎng)站進行，用ProtScale進行疏水性分析并使用GraphPad prism軟件處理數(shù)據(jù)，用SignalP-4.0檢測信號肽區(qū)域，以PredictProtein預(yù)測跨膜區(qū)域，進行亞細(xì)胞內(nèi)定位。使用MEGA5.0軟件對擬南芥的AtRED14(AT1G76180.1)、AtLTI29(CAA62448.1)、AtHIRD11(OAP19672.1) 和AtLTI30(CAA54704.1)；水稻的OsRAB21(CAA68765.1) 和OsWSI724(BAA05539.1)；玉米ZmRAB17(CAM56275.1)；小麥TaWZY1-2(ABV24865)、TaWCS120(AAA34261.2)、TaDHN-1(AB272228.1)；大麥的HvDHN3(AAD02255.1)和 HvDHN13(AAT81473.1)進行蛋白序列聚類分析。

1.5 小麥 TaDHN-2>基因的表達(dá)模式分析

依據(jù)克隆后測序的結(jié)果設(shè)計實時定量特異引物TaDHN-2-3(5′-GGCATTTCCAGCCCTCG-3′)和TaDHN-2-4(5′-ATGACGCCCTTCTTC TCG-3′)；內(nèi)參基因為β-actin(Accession No.AB181991)，引物為actin-F(5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′)和actin-R(5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′)。表達(dá)特性分析采用實時定量RT-PCR的方法，使用Bio-Rad公司的IQ5 PCR 儀，程序為95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸35 s，35個循環(huán)。依據(jù)實時定量PCR獲得的內(nèi)標(biāo)基因β-actin和目的基因的Ct值，按照2-ΔΔCt法[21]計算目的基因的相對表達(dá)量，進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 原核表達(dá)載體構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)

依據(jù)前期保存的pET-28a質(zhì)粒，設(shè)計引入酶切位點EcoR I、XhoI的PCR引物，TaDHN-2-5(5′-CGCGAATTCCACCTGTGCAAGATGG-3′;圖1下劃線部分為EcoRI酶切位點)和 TaDHN-2-6(5′-TGCTCGAGTCTTTCACAAGTAGCGG-3′；圖1下劃線部分為XhoI酶切位點)。對PCR回收產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-28a的質(zhì)粒做EcoRI 和XhoI雙酶切，經(jīng)連接后將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 ，陽性克隆進行PCR驗證后提取質(zhì)粒再次酶切驗證并測序。將重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，挑取陽性克隆，接種于1 mL含有卡那霉素(50 mg·L-1)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日按1∶100的比例擴大培養(yǎng)，當(dāng)OD600到0.6時，分別加IPTG至終濃度1 mmol·L-1過夜培養(yǎng)。

1.7 重組目的蛋白的純化和對 α-淀粉酶活性影響分析

上述過夜菌液12 000 rpm離心收集菌體，1 g菌體加入4 mL結(jié)合緩沖液(10 mmol·L-1咪唑、50 mmol ·L-1NaH2PO4、300 mmol·L-1NaCl、pH 8.0)，懸浮菌液。冰上10 s間隔超聲破碎裂解菌體，4 ℃、12 000 r·min-1離心45 min收集上清液，上清液用0.45 μm的濾膜過濾，經(jīng)鎳柱純化目的蛋白。以Bradford 法[22]測定蛋白濃度。使用Western blot法[23]鑒定目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后，將目的蛋白所在的分離膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，在含有0.5%脫脂奶粉的TBST下浸泡過夜。用0.5% SMP的TBST稀釋HIS抗體(購于Abcam公司)孵育1 h，TBST洗滌干凈后，使用0.5% SMP稀釋酶標(biāo)記的第二抗體繼續(xù)孵育1 h。洗滌后使用天根公司的HRP-DAB試劑盒顯色，記錄試驗結(jié)果。

取α-淀粉酶提取液1 mL，加入目的蛋白，終濃度分別為0、10、20、60、100 μg·mL-1，每個濃度兩個重復(fù)，然后加入1 mL pH5.6檸檬酸。60 ℃和4 ℃分別水浴15 min后，加入等溫的淀粉溶液5 mL。水浴5 min后試驗組加入4 mL 0.4 mol·L-1NaOH終止反應(yīng)，取1 mL反應(yīng)液加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸煮沸5 min，稀釋至15 mL，測定OD510，計算。對照組用等體積500 mmol·L-1咪唑洗脫緩沖液代替目的蛋白溶液，并在水浴前加入4 mL 0.4 mol·L-1NaOH鈍化酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥脫水素基因 TaDHN-2>的克隆及其序列分析

分別以PEG處理6 h后洛旱2號三葉期葉片的cDNA和gDNA為模板，用特異引物(TaDHN-2-1和TaDHN-2-2)進行PCR擴增(圖1A，1B)。測序結(jié)果表明，以cDNA為模板的克隆基因大小為556 bp，其中5′ UTR 59 bp，3′UTR 38 bp，ORF大小為 459 bp。與cDNA序列比對，其gDNA包含一個109 bp的內(nèi)含子，符合GC/AG的剪切機制。進一步分析顯示，克隆基因可編碼152個氨基酸，分子量約15.52 kDa，等電點是7.17。氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，其富含親水性氨基酸Gly(G)、Thr(T)、Gln(Q)、Lys(K)(圖1C)，不含有疏水性氨基酸Cys(C)、Trp(W)。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blastp檢索，其與傘穗山羊草(Aegilopsumbellulata)中的脫水素基因CAJ56057.1序列同源性為81%，表明克隆的基因為脫水素基因，將其命名為 TaDHN-2>。

A： TaDHN-2> 的cDNA擴增結(jié)果；B： TaDHN-2>的gDNA擴增結(jié)果；A、B圖中的1和M分別指 TaDHN-2>目的片段和DL2000 DNA Marker；C： TaDHN-2>氨基酸組成及含量分析；D： TaDHN-2>序列特性。A:cDNA products of the TaDHN-2>; B:gDNA amplification of the TaDHN-2>; 1 and M in chart A and B refer to target fragment of TaDHN-2 and DL2000 DNA marker, respectively; C:Analysis of amino acid composition and content of TaDHN-2>; D:The DNA and protein sequences of TaDHN-2>.

2.2 小麥脫水素TaDHN-2的結(jié)構(gòu)特性分析

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，小麥脫水素TaDHN-2可形成 α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲，占氨基酸比例分別為16.45%(25)、9.21%(14)、12.50%(19)、61.84%(94)(圖2A)。小麥脫水素TaDHN-2的親水性強(圖2B)，沒有信號肽區(qū)域(SignalP-4.0)和跨膜區(qū)域，亞細(xì)胞定位到細(xì)胞質(zhì)中。系統(tǒng)進化分析表明，小麥脫水素TaDHN-2與擬南芥AtRAB18和水稻OsRAB21同屬脫水素的YnSkn亞類(圖2C)。經(jīng)進一步分析，小麥脫水素TaDHN-2的37～151氨基酸位點為脫水素保守結(jié)構(gòu)域(圖1D)，具有YnSKn類脫水素典型保守結(jié)構(gòu)，包括N端的Y片段(16～22，VDEYGNP)、S片段(59～74，SSSSSEDDGMGGRRKK)以及C端的兩個K片段保守結(jié)構(gòu)域(79～86和143～150; KIKEKLPG)。

A：TaDHN-2的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，h： α-螺旋，t：β-轉(zhuǎn)角，e：伸展鏈，c：無規(guī)則卷曲；B：TaDHN-2蛋白的氨基酸序列親/疏水性預(yù)測；C：TaDHN-2與其他脫水素蛋白的系統(tǒng)進化分析。A:Secondary structure of TaDHN-2, h:Alpha-helix, t:Beta-turn, e:Extended strand, c:Random coil; B:hydrophily/hydrophobicity of TaDHN-2; C:Phylogentic tree of TaDHN-2 and other dehydrins.

2.3 小麥脫水素基因 TaDHN-2>對脫落酸ABA的響應(yīng)

在100 μmol·L-1ABA處理1 h后， TaDHN-2>在中國春根系中的表達(dá)量最高，是對照的5.3倍。ABA處理之后的2～48 h，其表達(dá)量與對照沒有明顯差異。在洛旱2號根系中，在ABA處理后，隨時間的延長， TaDHN-2>表達(dá)量逐漸增高，在處理6 h時達(dá)到最高，是對照的6.3倍，之后其表達(dá)量逐漸下降(圖3A)。在中國春葉中的表達(dá)模式與根系相似，而洛旱2號葉片中 TaDHN-2>基因在在ABA誘導(dǎo)后2 h增強表達(dá)，在ABA處理12 h時其表達(dá)量快速增高到4.9倍，達(dá)到最高(圖3B)。總體上看來，在ABA誘導(dǎo)下根系的 TaDHN-2>表達(dá)模式與葉片相近，但是其在洛旱2號中對ABA脅迫響應(yīng)速度慢于中國春，但整體持續(xù)增強表達(dá)時間較長，這可能與洛旱2號具有較強耐旱能力有關(guān)。

2.4 小麥脫水素基因 TaDHN-2>對滲透脅迫的響應(yīng)

在20% PEG6000處理6 h后，中國春根系 TaDHN-2>的表達(dá)量達(dá)到最高，是對照的10倍。處理12～48 h表達(dá)量緩慢下降到對照水平。而洛旱2號根系的 TaDHN-2>表達(dá)量在20% PEG6000處理0.5 h時達(dá)到最高，為對照2.3倍，之后其表達(dá)量與對照沒有顯著差異(圖4A)。在洛旱2號和中國春的葉中， TaDHN-2>具有相似的表達(dá)模式，但其在洛旱2號中的相對表達(dá)量變化較中國春更為明顯，在20%PEG6000處理1 h時， TaDHN-2>在兩個品種中的表達(dá)量均最高，洛旱2號和中國春中的表達(dá)量分別為對照的5.3和3.8倍(圖4B)。

鹽脅迫過程中，中國春根系的 TaDHN-2>表達(dá)量呈波動性變化，在處理2 h、48 h時表達(dá)量出現(xiàn)兩個峰值，分別是對照的5和4.8倍，但在洛旱2號根系中該基因表達(dá)變化不明顯(圖4C)。在葉片中，洛旱2號的 TaDHN-2>表達(dá)量在鹽處理后6 h時最高，是對照的5倍；而中國春的 TaDHN-2>表達(dá)量在不同處理時間與對照無明顯差異(圖4D)。

綜上所述， TaDHN-2>在2個品種中具有不同的誘導(dǎo)表達(dá)模式，在根系中在中國春中的誘導(dǎo)表達(dá)量顯著高于洛旱2號，而在洛旱2號葉片中的誘導(dǎo)表達(dá)量更高。

圖3 ABA處理下小麥 TaDHN-2>在小麥根(A)和葉片(B)中的表達(dá)模式Fig.3 Expression pattern of TaDHN-2 in wheat root(A) and leaf(B) under ABA treatment

圖4 滲透脅迫下小麥 TaDHN-2>在根(左)和葉片(右)中的表達(dá)模式Fig.4 Expression profile of TaDHN-2 in wheat root(leaf) and leaf(right) under osmotic stress

2.5 小麥TaDHN-2對酶活性的保護功能分析

將包含完整ORF的目的基因插入pET-28a表達(dá)載體MCS區(qū)域的3′末端，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，PCR鑒定篩選陽性克隆(圖5A)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)HIS-TaDHN-2融合蛋白，鎳柱純化后，Western blot結(jié)果顯示，在15 kDa有雜交條帶(圖5B)，表明HIS-TaDHN-2純化成功。

同α-淀粉酶提取液中添加融合蛋白，結(jié)果表明，在60 ℃下，α-淀粉酶活性隨著HIS-TaDHN-2濃度的增加而提高；在融合蛋白的濃度為100 μg·mL-1時， α-淀粉酶的活性提高到對照的2倍(圖6A)。在4 ℃條件下，融合蛋白濃度低于20 μg·mL-1時，HIS-TaDHN-2對α-淀粉酶活性沒有影響；當(dāng)融合蛋白濃度達(dá)到60 μg·mL-1時， α-淀粉酶活性顯著增強，并隨加入融合蛋白濃度的增大而提高，當(dāng)加入濃度為100 μg·mL-1， α-淀粉酶活性提高為對照的1.6倍(圖6B)。綜合上述結(jié)果說明，TaDHN-2在60 ℃和4 ℃可以提高α-淀粉酶的活性，對溫度引起的酶活性下降具有一定的保護作用。

A圖中，M表示DL2000 DNA marker；1～3：單克隆菌液。B圖中，M：94 kDa；2：目的蛋白。In chart A,M:DNA marker DL2000;1-3:Bacteria liquid of monoclonal;In chart B,M:94 kDa；2:Target protein.

圖6 融合蛋白HIS-TaDHN-2對α-淀粉酶活性的影響Fig.6 Effect of HIS-TaDHN-2 on the activity of α-amylase

3 討 論

逆境脅迫嚴(yán)重影響著植物生長發(fā)育的進程[24]。脫水素是一類在逆境脅迫條件下(如干旱和高鹽等)大量表達(dá)的功能蛋白[7]。DHN蛋白通常含有高度保守的C端K片段[EKKGIME/DKIKEKLPG]、N端的Y片段[保守的(V/T)D(E/Q)YGNP]和中間的4～10個絲氨酸殘基串的S片段[LHRSGS4～10(E/D)]，根據(jù)三個保守區(qū)域的組成不同，將脫水素分成SKn、Kn、YnSKn、KnS和YnKn五類[7,25]。本研究克隆的 TaDHN-2>的編碼蛋白包含兩個K片段保守結(jié)構(gòu)域(C端)、1個Y片段和1個S片段保守域(N端)，屬于典型的YnSKn類脫水素。研究發(fā)現(xiàn)，脫水素K片段可以形成與A2相似的雙親性α-螺旋并與蛋白質(zhì)的疏水作用位點結(jié)合，避免蛋白質(zhì)的不可逆變性和聚集[26-27]。K片段保守域有可能與 TaDHN-2>在抗逆過程中的響應(yīng)密切相關(guān)[28]。另外， TaDHN-2>還有N端豆蔻?；稽c，CK2磷酸化位點，和酰胺化位點，這些位點也可能在脫水素行使功能的過程中發(fā)揮重要作用，但具體的機理還有待進一步研究。

植物的非生物脅迫響應(yīng)包括ABA的依賴型和非依賴型兩個類型，前者在干旱等細(xì)胞脫水脅迫過程中發(fā)揮了極其重要的功能[29]。在本實驗所用的兩個小麥品種中， TaDHN-2>在ABA的誘導(dǎo)下均上調(diào)表達(dá)，證明該基因?qū)儆贏BA依賴型的非生物脅迫響應(yīng)途徑。脫水素在不同的組織、器官以及不同的逆境環(huán)境下有不盡相同的表達(dá)模式。如大麥中的YnSKn型脫水素基因 DHN12>只在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，而營養(yǎng)組織中不表達(dá)[30]；Yang等[31]對葡萄的多個脫水素基因進行研究發(fā)現(xiàn)，干旱條件下只有DHN1表達(dá)；本研究結(jié)果表明， TaDHN-2>在小麥根系和葉片中均可被誘導(dǎo)表達(dá)，但是抗旱品種洛旱2號中其被誘導(dǎo)表達(dá)的時間明顯長于中國春，推測這可能與洛旱2號抗逆性強的品種特性有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，小麥WRAB18、玉米ZmLEA3和高粱SbDhn2脫水素蛋白K片段形成的α-螺旋結(jié)構(gòu)可能與變性的LDH疏水基團作用，防止LDH進一步變性，以維持乳酸脫氫酶的正常功能[32-35]。Nakayama等[9]在對Cor15am的研究中發(fā)現(xiàn)，其在溫度低于43 ℃的條件下對酶底物具有一定的保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TaDHN-2融合蛋白的濃度為100 μg·mL-1時，在溫度為60和4 ℃的條件下均能有效提高α-淀粉酶活性，這說明TaDHN-2蛋白對維持酶活性的功能具有積極作用，這是否與逆境脅迫下功能蛋白的活性保護有關(guān)仍有待于進一步證實。