鄒玉霞，馬云桐，毛勝楠，鐘芙蓉，申嬋

瘤毛獐牙菜（Swertia pseudochinensisHara）為龍膽科獐牙菜屬植物，主要野生分布于我國河北、吉林、遼寧、黑龍江等地。2015年版《中國藥典》記載其以干燥全草入藥，藥材名為當(dāng)藥，具清濕熱、健胃的功效，用于治療濕熱黃疸，脅痛，痢疾腹痛，食欲不振[1]。

商品主要來源于野生，近年來野生資源的急劇減少，不足以滿足市場需求。關(guān)于瘤毛獐牙菜的組培快繁已有相關(guān)研究[2]，為了完善和優(yōu)化瘤毛獐牙菜快繁體系的建立，本研究以瘤毛獐牙菜嫩莖和嫩葉為材料，采用L9(34)正交試驗(yàn)探索植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)瘤毛獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響；并對(duì)誘導(dǎo)出的胚性與非胚性愈傷組織進(jìn)行可溶性糖、可溶性蛋白含量及抗氧化物酶（SOD、POD、CAT）活性的測定，以期揭示愈傷組織誘導(dǎo)的潛在能力，為進(jìn)一步建立愈傷組織的胚胎發(fā)生能力與生化代謝間的關(guān)系提供依據(jù)，為研究其體細(xì)胞胚胎發(fā)生奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 外植體

供試品于2015年采自河北省承德市圍場內(nèi)健壯無病蟲害的植株，經(jīng)鑒定為瘤毛獐牙菜（Swertia pseudochinensisHara），選取成熟種子種于溫室內(nèi)，次年四月取其嫩莖及嫩葉為外植體。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 超凈工作臺(tái)（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）、YH-JZ-Ⅱ接種器械滅菌器（上海宇涵生物科技有限公司）、GTOP系列智能光照培養(yǎng)箱（浙江托普儀器有限公司）、離心機(jī)（Hitachi centrifuge CT15RE）、全自動(dòng)樣品快速研磨儀（Tissuelyser-48上海凈信科技）、96孔板、EP管、酶標(biāo)儀（Thermo scientificTM varioskanTM FLASH）、移液槍（eppeudorf Research plus）等。

1.2.2 試劑 0.1% HgCl2；植物生長調(diào)節(jié)劑6-芐氨基嘌呤（6-BA）、2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D）、玉米素（ZT）；可溶性蛋白、可溶性糖、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 外植體處理

取瘤毛獐牙菜嫩莖及嫩葉，流水下沖洗30 min，置于超凈工作臺(tái)上。用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次；0.1% HgCl2溶液浸泡5-6 min，無菌水沖洗5次，獲得無菌嫩莖嫩葉。

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2.1 瘤毛獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 以MS為基本培養(yǎng)基；植物生長調(diào)節(jié)劑2, 4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）分別為A、B和C 3因素，每個(gè)因素各取3水平，應(yīng)用正交表L9(34)設(shè)計(jì)不同因素水平配比的培養(yǎng)基（表1）；加入30 g/L 白糖和4.5 g/L瓊脂；pH值調(diào)至5.8～6.0；在121℃、1.1 kg/cm2的高壓滅菌鍋下滅菌30 min。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)L9(34)正交設(shè)計(jì)

2.2.2 接種培養(yǎng)與觀察 在無菌條件下，將嫩莖剪成0.5-1 cm的小段，葉片剪成0.5 cm2的小塊分別接入含有不同激素培養(yǎng)基的組培瓶中，培養(yǎng)條件分別為A（光照）：（25±1）℃、光照強(qiáng)度1500 lx、光照時(shí)間10 h/d；B（黑暗）：（25±1）℃、黑暗條件。

以上每個(gè)處理10瓶，每瓶8個(gè)接種點(diǎn)，每7 d觀察一次并做記錄，40 d統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，中途長菌的不計(jì)入最終結(jié)果。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）＝產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接入的外植體數(shù)

2.3 不同愈傷組織的生理生化研究

以繼代40 d后的瘤毛獐牙菜胚性愈傷組織（embryogenic callus， EC）和非胚性愈傷組織（non-embryogenic callus ，N-EC）為材料，按照試劑盒說明書分別測定兩者中可溶性糖、可溶性蛋白含量以及過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性并比較分析。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft excel 2013對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖，SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

表2 瘤毛獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)率

3 結(jié)果與分析

3.1 瘤毛獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)率及外植體形態(tài)變化

表3 瘤毛獐牙菜愈傷組織的形態(tài)變化

3.1.1 不同外植體及光照對(duì)愈傷組織生長的影響 結(jié)合表2及表3可知：嫩莖和嫩葉作為外植體均能誘導(dǎo)出愈傷組織，當(dāng)僅從誘導(dǎo)率上觀察，同等條件下，嫩莖誘導(dǎo)率大多高于嫩葉誘導(dǎo)率。以愈傷誘導(dǎo)率、愈傷形態(tài)及愈傷形成時(shí)間作為評(píng)判指標(biāo)時(shí)，嫩莖更適宜做外植體。對(duì)比光照及黑暗條件，發(fā)現(xiàn)黑暗條件下愈傷組織生長速度較快，出愈時(shí)間較早。

3.1.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織生長的影響

表4 極差分析與方差分析（根據(jù)光照條件下嫩莖誘導(dǎo)率）

結(jié)合不同外植體及光照條件考察結(jié)果，對(duì)表2中瘤毛獐牙菜的愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行極差及方差分析，結(jié)果如表3所示。2，4-D、6-BA 和ZT 3個(gè)因素對(duì)瘤毛獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)率的影響均不顯著，但影響程度略有差異，3種激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響依次為B(6-BA)＞A（2，4-D）＞C（ZT）。2,4-D、6-BA和ZT 3因素及其質(zhì)量濃度水平最佳組合為B3A2C3，即MS＋6-BA1mg/L+2,4-D2 mg/L+ZT0.9 mg/L為瘤毛獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

3.2 胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的生理生化研究

將愈傷組織轉(zhuǎn)接入篩選出的最佳培養(yǎng)基中，隨著愈傷組織的生長，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)了兩種不同類型。一種呈淺白色或白色，半透明，粘質(zhì)狀，具分化能力，在培養(yǎng)后期分化出胚狀體，這種愈傷組織為EC；另一種呈黃色或淺黃色，半透明，結(jié)構(gòu)疏松，表面粗糙或呈結(jié)晶狀，繼代培養(yǎng)之后只發(fā)生體積上的擴(kuò)增，而沒有胚狀體的分化，這種愈傷組織為N-EC。其中EC具有再生潛能，在適宜的條件下可繼續(xù)分化成具胚胎發(fā)生能力的胚狀體；而N-EC難以分化成功，再生成植株的可能性也較小[3,4]。這2種類型的愈傷組織通常根據(jù)其形態(tài)、顏色便可加以區(qū)別[5,6]。對(duì)這兩種愈傷組織分別進(jìn)行可溶性糖、可溶性蛋白及CAT、SOD、POD的測定。

3.2.1 蛋白質(zhì)含量與可溶性糖含量

圖1 不同類型愈傷組織蛋白質(zhì)和可溶性糖含量差異

瘤毛獐牙菜EC和N-EC的蛋白質(zhì)、可溶性糖含量測定結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明EC的蛋白質(zhì)與可溶性糖含量分別為41.11 mg/g、15.91 mg/g，均顯著高于N-EC中的含量。

3.2.2 抗氧化酶（CAT、SOD、POD）活性

表5 不同愈傷組織抗氧化物酶活性及t檢驗(yàn)

瘤毛獐牙菜EC與N-EC中CAT、SOD、POD活性測定結(jié)果及使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)其差異顯著性結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明EC中的CAT活性顯著高于N-EC；SOD活性低于N-EC，但未達(dá)到顯著性水平；POD活性顯著低于N-EC。

4 討論與結(jié)論

李茜茹[2]等人以瘤毛獐牙菜嫩莖為外植體對(duì)其組織培養(yǎng)及無性系建立進(jìn)行了初步研究，本研究在其基礎(chǔ)上對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化和完善，并根據(jù)愈傷組織的形態(tài)將其分為了胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，同時(shí)測定了兩種愈傷組織內(nèi)抗氧化酶活性和可溶性糖、可溶性蛋白含量，揭示了兩種不同愈傷組織的生理狀態(tài)，為進(jìn)一步分化和發(fā)育成苗提供指導(dǎo)意義。

4.1 本實(shí)驗(yàn)對(duì)瘤毛獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果表明：黑暗條件有利于愈傷組織的形成，嫩莖相比嫩葉更有利于愈傷組織的形成且胚性組織較多。王榮明[7]、付偉[8]等在研究不同因素對(duì)南方紅豆杉以及中華卷柏愈傷組織誘導(dǎo)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，光照對(duì)愈傷組織的形成有抑制作用，暗培養(yǎng)可以在一定程度上減輕愈傷組織的褐變，與此實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。在愈傷誘導(dǎo)階段，ZT、6-BA、2，4-D發(fā)揮了不同的作用，MS＋6-BA1mg/L+2,4-D2 mg/L+ZT0.9mg/L為瘤毛獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

4.2 通過對(duì)瘤毛獐牙菜EC與N-EC生理生化指標(biāo)的測定，發(fā)現(xiàn)EC中可溶性糖及蛋白質(zhì)均顯著高于N-EC，表明EC代謝旺盛，蛋白質(zhì)合成活躍，為后期細(xì)胞的分化做準(zhǔn)備。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與孟姣等[9]在栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織生化特性研究中的報(bào)道一致。這在后續(xù)快繁體系的建立中，對(duì)培養(yǎng)基的選擇提供了參考依據(jù)。

4.3 抗氧化酶類物質(zhì)活性測定結(jié)果顯示，EC中CAT的活性顯著高于N-EC，表明EC生理代謝強(qiáng)，清除自由基能力高，活力旺盛；EC與N-EC中SOD差異不明顯；N-EC中POD高于EC，POD是木質(zhì)素合成代謝中的關(guān)鍵酶，其含量與木質(zhì)素合成的量成正相關(guān)，而木質(zhì)素在細(xì)胞壁中有支撐細(xì)胞強(qiáng)度的作用[10]。從形態(tài)特征可見，N-EC結(jié)構(gòu)致密，不易分散，表明N-EC細(xì)胞壁形成的木質(zhì)素與POD有關(guān)。