李皓月，梁浩

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcertive colitis，UC)又稱為慢性非特異性炎癥性腸病，是一種慢性持續(xù)性、反復(fù)發(fā)作的腸道炎癥性疾病[1]。本病好發(fā)于直腸及乙狀結(jié)腸，甚至可延伸至整個結(jié)腸，其病變部位多局限于腸道黏膜和黏膜下層，臨床以腹痛、腹瀉和黏液樣膿血便為主要特征[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(Toll-like receptors，TLR4)能夠通過髓樣分化初級反應(yīng)88(Myeloid differentiation primary response 88，MyD88)蛋白激活核因子κB(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB)信號通路，并促進下游炎性細胞因子的分泌，從而誘導(dǎo)UC的發(fā)病及發(fā)展[3]。針灸治療本病具有廣闊的發(fā)展前景和獨特的優(yōu)勢，不僅效果理想，而且不良反應(yīng)少，安全性高，易被廣大患者的接受[4]。然而目前對于針灸治療本病的作用機制尚不明確，因此本研究通過電針對比假電針組及柳氮磺胺吡啶(SASP)組，觀察TLR4/NF-κB信號通路中相關(guān)蛋白及mRNA的表達來探討電針的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 75只雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(210±15)g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(黑)2013-0002，動物隨機分成空白組、模型組、電針組、假電針組和SASP組，每組15只，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，每天定時清潔籠舍。飼養(yǎng)于溫度22～25℃，相對濕度55%～75%，12 h晝夜循環(huán)照明的環(huán)境中。

1.2 藥物及試劑 2，4，6三硝基苯磺酸溶液(2，4，6-Trinitrobenzene sulfonicacid solution，TNBS)美國 Sigma公司生產(chǎn)。無水乙醇、水合氯醛，上海基免生物科技有限公司生產(chǎn)；柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine，SASP)，上海三維制藥有限公司生產(chǎn)；BCA蛋白定量試劑盒，美國Sigma公司生產(chǎn)；Trizol RNA提取試劑盒，美國Inviyrogen公司生產(chǎn)；白細胞介素-1β(Interleuki-1β， IL-1β)、 腫 瘤 壞 死 因 子 -α (Tumor Necrosis Factor，TNF-α)、白細胞介素 -10(Interleuki-10，IL-10)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，美國R&D Systems公司生產(chǎn)；TLR4、MyD88、NF-κB p65及β-actin兔抗鼠單克隆抗體，上?？道噬锟萍加邢薰旧a(chǎn)；山羊抗兔二抗，美國Licor公司生產(chǎn)；TLR4、MyD88、NF-κB p65及β-actin基因引物由上海生工生物工程公司生產(chǎn)；一步法RT-PCR試劑盒，天根生化科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 3-18KS臺式高速冷凍離心機(Sigma，USA)，902-ULTS超低溫冰箱(Thermo，USA)，HBS-1096A酶標儀(南京德鐵實驗設(shè)備有限公司)，半干式轉(zhuǎn)膜槽、Mini-PROTEAN Tetra電泳槽(Bio-Rad，USA)，Tanon 1600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，T100 PCR儀(Bio-Rad，USA)，0.25 mm×25 mm一次性使用無菌針灸針(貴州安迪藥械有限公司)，KWD-808脈沖針灸治療儀(常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司)，CX41光學(xué)顯微鏡(Olympus，Japan)。

1.4 模型制備 除空白組外，余下4組大鼠均按照徐陽等[5]的方法制造大鼠UC模型。造模前大鼠禁食24 h，禁水2 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，模型組、電針組、假電針組和SASP組大鼠采用灌胃針輕插入肛門深約8 cm處，一次性灌入TNBS混合液(50%乙醇0.25 mL+TNBS原液100 mg/kg)，空白組灌入等體積的0.9%的氯化鈉注射液。結(jié)束后將大鼠肛門捏緊并提尾倒立10 min，放回飼養(yǎng)籠中。

1.5 干預(yù)方法 造模結(jié)束后開始干預(yù)治療?？瞻捉M不做任何干預(yù)，只做相同的抓取固定。電針組給予針刺雙側(cè)“天樞穴”，天樞穴參照《實驗針灸學(xué)》中定位標準，假電針組給予針刺雙側(cè)“天樞穴”旁開1寸，針刺后連接電針儀，頻率10～20Hz，電流強度2～4 mA，針刺時間為30 min，每天治療1次。SASP組以10 mL/kg SASP懸濁液灌胃治療，模型組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃治療，每天1次。

1.6 標本采集 連續(xù)治療10天后，大鼠禁食24 h用10%水合氯醛再次腹腔注射麻醉后，開腹，腹主動脈取血，靜置2 h，2 500 r/min離心5 min，取上清液置于-70℃冰箱中保存進行ELISA檢測。取結(jié)腸組織6 cm，剪取1 cm×1 cm病變結(jié)腸組織后后固定于10%福爾馬林溶液中24 h，酒精脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片后進行蘇木精-伊紅(HE)染色，余下結(jié)腸組織置于-70℃冰箱中保存，用于Western-blot及RT-PCR檢測。

1.7 觀察一般情況及檢測指標 分別觀察各組治療后大鼠的體質(zhì)量、毛發(fā)光澤度、精神狀態(tài)、大便性狀及活動的情況。根據(jù)文獻[6]制定的DAI評分標準，分別評價各組大鼠治療后UC疾病活動情況。光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài)，HE染色按照試劑盒說明書嚴格操作。測定各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-10的水平，檢測方法嚴格按照ELISA說明書操作步驟。

(1)取20 mg結(jié)腸組織粉碎后加入RIPA裂解液及PMSF后電動均漿，BCA法蛋白質(zhì)濃度測定，SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后3%BSA室溫封閉。加入TLR4、MyD88、NF-κB p65 一抗(1∶2 000)，β-actin 作為對照(1∶10 000)，孵育過夜后洗滌加入HRP標記的二抗后孵育1 h。(2)Image J軟件分析Western blot結(jié)果，以TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白與β-actin內(nèi)參的比值表示目標蛋白的相對表達量。(3)取20 mg結(jié)腸組織粉碎后均漿，按Trizol試劑盒方法提取RNA瓊膠糖電泳以確定RNA的完整性后進行RNA純度和濃度的檢測。合成相關(guān)引物，TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA引物序列見表1。

(1)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于PCR管中加入標本RNA 5 μg，隨機引物 1 μL，RNase free ddH2O 5 μL，混勻后 70℃水浴5 min，冰浴10 s，離心，加入5×Reaction Buffer 4 μL，RNA酶抑制劑 1 μL，dNTP 混合物 2 μL，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 2 μL，37℃水浴5 min，42℃水浴60 min，70℃水浴10 min后終止反應(yīng)，-20℃保存。(2)以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為預(yù)變性95℃2 min后進行循環(huán)；95℃20 s，60℃25 s，72℃30 s，45個循環(huán)，將PCR產(chǎn)物在瓊脂凝膠中進行電泳，紫外燈下照相，凝膠圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，以TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA條帶與GADPH條帶的比值表示目標基因的相對表達量。

表1 TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA 引物

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，各組計量數(shù)據(jù)均以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用Q檢驗(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 見圖1A。與空白組比較，模型組及假電針組大鼠體質(zhì)量下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；模型組大鼠皮毛枯黃無光澤，精神萎靡、蜷縮而臥，出現(xiàn)黏液樣膿血便；電針組和SASP組大鼠體質(zhì)量、毛發(fā)光澤度、精神狀態(tài)、大便性狀等情況均有不同程度的改善，其中電針組優(yōu)于SASP組。

2.2 各組大鼠DAI評分結(jié)果比較 見圖1B。與空白組比較，模型組大鼠DAI評分顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，假電針組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，電針組和SASP組DAI評分顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與SASP組比較，電針組DAI評分較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量及DAI評分結(jié)果比較

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果比較 見圖2?？瞻捉M結(jié)腸黏膜表面光滑，上皮完整，固有層無炎性細胞，黏膜下層未見充血、水腫及炎性細胞浸潤；模型組及假電針組結(jié)腸黏膜表面無上皮覆蓋，黏膜層隱窩壞死，伴潰瘍形成累及各層腸壁。電針組和SASP組結(jié)腸黏膜可見部分杯狀細胞及腺體，仍存在炎性細胞浸潤，潰瘍程度較模型組顯著改善，其中以電針組改善最為明顯。

2.4 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-10檢測結(jié)果比較 見圖3。與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量顯著增高，IL-10含量顯著降低(P＜0.05)。與模型組比較，電針組、SASP組血清IL-1β、TNF-α含量顯著降低，IL-10含量顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而假電針組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與SASP組比較，電針組IL-1β含量較低、IL-10含量較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，TNF-α含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達結(jié)果比較 見圖4。與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白的表達顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，電針組、SASP組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，假電針組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與SASP組比較，電針組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白均較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.6 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達結(jié)果比較 見圖5。與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的表達顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，電針組、SASP組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，假電針組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與SASP組比較，電針組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果比較 (×100)

圖3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-10檢測結(jié)果比較

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達結(jié)果比較

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達結(jié)果比較

3 討論

Toll樣受體(TLRs)屬于跨膜蛋白受體，由胞內(nèi)段、跨膜區(qū)和胞外段組成，其中胞內(nèi)段由長短不一的短尾肽和Toll同源結(jié)構(gòu)域組成。TLRs能夠識別脂蛋白、脂多糖、病原微生物，從而激活免疫系統(tǒng)，刺激細胞因子的釋放和刺激分子的表達，是先天性免疫識別系統(tǒng)的重要組成部分[7]。TLR4分布于除B細胞、T細胞和NK細胞以外的免疫細胞中，能夠介導(dǎo)腸上皮細胞對細胞壁中脂多糖的高反應(yīng)性，還能在輔助因子的參與下激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與炎癥反應(yīng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)TLR4能夠非特異性的結(jié)合病原相關(guān)分子，介導(dǎo)信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)參與UC的發(fā)病，從而促進腸道炎癥的釋放[9]。MyD88是TLRs胞內(nèi)段的接頭蛋白，TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴性途徑能夠通過激活NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)參與炎癥反應(yīng)，在TLR信號通路中起著關(guān)鍵的作用。陳曉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，UC模型大鼠結(jié)腸組織中MyD88的表達較正常對照組大鼠顯著增高，且MyD88的水平與腸道炎癥程度呈正相關(guān)。NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子，具有多種生物活性，而其介導(dǎo)的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠參與機體的免疫炎癥反應(yīng)。NF-κB在正常狀態(tài)下以復(fù)合物的形式存在于細胞質(zhì)中，細胞外信號通過磷酸化的形式激活I(lǐng)κB激酶，活化NF-κB，分泌IL-1β、TNF-α、iNOS、VCAM-1等多種炎癥介質(zhì)及因子，從而誘導(dǎo)UC的發(fā)生與發(fā)展[11]。

UC屬于中醫(yī)腸澼、泄瀉、久痢的范疇，本病多由外感風、寒、濕邪，或是起居失常，或飲食不潔或不節(jié)，導(dǎo)致濕濁困阻中焦，耗傷脾胃，淤而熱化，下注大腸，阻礙氣機運行以致血瘀。因此本病以濕熱、血瘀為主要病機，然而濕熱之邪，纏綿不愈。針灸療法作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶，在UC的治療方面取得了良好的臨床療效。劉朝等[12]通過對近15年針灸治療UC的臨床隨機對照試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，天樞穴使用頻率為13.54%，為治療UC的第二大要穴。天樞穴隸屬于足陽明胃經(jīng)，位于臍旁2寸，左右各一，為大腸治募穴。天樞穴具有消食導(dǎo)滯、疏調(diào)腸腑、化瘀止痛的功效，正如《針灸大成》中記載“脾泄之癥別無他，天樞二穴刺休差”?！夺t(yī)宗金鑒·刺灸心法要訣》謂“天樞穴，主治主治內(nèi)傷脾胃，赤白痢疾，脾瀉及臍腹鼓脹，癌瘕等證”?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，電針天樞穴不僅能夠顯著改善UC大鼠結(jié)腸黏膜病理組織形態(tài)學(xué)，還能夠顯著上調(diào)組織中熱休克蛋白-70和抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的表達，從而有效控制炎癥及免疫級聯(lián)反應(yīng)[13]。

為進一步明確針灸治療UC的具體作用機制，本研究通過TBNS/乙醇制造UC模型，以假電針組及SASP為雙向?qū)φ眨芯拷Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模后模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量及結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白及mRNA的表達顯著增高，IL-10含量顯著降低；干預(yù)治療后，電針組及SASP組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量及結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白及mRNA的表達顯著降低，IL-10含量顯著增高，且電針組在血清IL-1β、IL-10含量及結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達方面，明顯優(yōu)于SASP組，在血清TNF-α的含量及及結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的表達方面，2組間比較未見明顯差異性。此外，假電針組不僅不能改善UC的一般狀況及結(jié)腸黏膜形態(tài)，而且在血清IL-1β、TNF-α、IL-10含量及結(jié)腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白及mRNA的表達方面，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明電針刺激本身對UC病變無明顯療效，進一步說明腧穴在治療本病中的特異性。

綜上，電針天樞穴能夠明顯改善UC大鼠的結(jié)腸組織病理學(xué)形態(tài)，降低DAI評分，治療UC，其作用機制是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化實現(xiàn)的。