鄒亞麗，唐慧安，李長江，呼麗萍，王弋博

（1.天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，天水師范學(xué)院新型分子材料設(shè)計與功能重點實驗室，甘肅大櫻桃工程技術(shù)研究中心，甘肅 天水 741001；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045）

近20年來，糖尿病發(fā)病率迅速上升，以2型糖尿?。═2DM）更甚。[1]臨床上T2DM主要用阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇為代表的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物進(jìn)行治療，其作用機(jī)理是形成酶-抑制劑復(fù)合物而使酶失活以阻礙碳水化合物的代謝，控制血糖含量。這類化合物具有一定的副作用，表現(xiàn)為：長期服用阿卡波糖等藥物后會產(chǎn)生腸胃脹氣，惡心、腹痛、胃疼等腸胃不良癥狀，還產(chǎn)生肝損害和藥物性肝炎等毒副作用。[2-4]近年來研究發(fā)現(xiàn)釩化合物能增加機(jī)體組織對胰島素的敏感性，具有抗糖尿病、抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)等多方面功能，且有機(jī)釩配合物的降糖效果優(yōu)于無機(jī)釩化合物，[5]但呋喃甲酸類氧釩[6]及氧釩羧酸類配合物也有一定的胃腸道毒副反應(yīng)，[7]高劑量的釩還可能使釩蓄積在線粒體內(nèi)，抑制線粒體呼吸功能氧化應(yīng)激和呼吸抑制導(dǎo)致機(jī)體中毒，[8]因此低毒的有機(jī)羧酸或有抗糖尿病活性的有機(jī)藥物為配體的釩配合物，已成為目前釩配合物降糖的熱點之一。研究表明黃酮配合物可作為抗氧化劑減輕或消除釩對線粒體的毒性作用，消除釩配合物對細(xì)胞連接的破壞，[9-10]本研究基于此采用化學(xué)方法合成了楊梅黃酮合氧釩，以紫外光譜、紅外光譜等手段對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并探究了其對α-葡萄糖苷酶抑制作用和其酶催化動力學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-葡萄糖苷酶（美國Sigma公司），阿卡波糖（上海史瑞可生物有限公司）；二甲雙胍（Sell?ick公司），4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，上海葉源生物）；3,5-二硝基水楊酸、苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉等藥品均為上海生工產(chǎn)品；楊梅黃酮（武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司），紫外分光光度計（lambda35，PerkinEl?mer），傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet 6700，Thermo Fisher），酶標(biāo)儀 （Multiskan FC，Thermo Fisher）

1.2 合成方法

將2.9697g(0.0162mol)V2O5與6.06 mLH2SO4(17.35 mol/L，0.105mol)加入圓底燒瓶，90℃加熱并攪拌60min.冷卻加少量蒸餾水稀釋，加入1.4694g(0.0162mol)H2C2O4，加熱并攪拌，反應(yīng)溫度60℃，時間10h，得硫酸氧釩溶液。然后將26.8191g(0.1050mol)Ba(Ac)2配成溶液，邊攪拌邊滴加到硫酸氧釩溶液中，過濾后將其加熱濃縮后置于50℃電熱真空干燥箱24h得醋酸氧釩晶體。將0.3182(1mmol)楊梅黃酮與50mL乙醇加入圓底燒瓶，升溫至65℃加熱并攪拌60min，到楊梅黃酮完全溶解，緩慢滴加50mL含0.1190g(0.5mmol)醋酸氧釩的無水乙醇溶液后，緩慢加入10 mL乙醇鈉溶液，65℃回流反應(yīng)3h，出現(xiàn)褐色沉淀，過濾洗滌，將生成物置于50℃真空干燥箱內(nèi)干燥24h，得楊梅黃酮合氧釩，其結(jié)構(gòu)式如下：

1.3 結(jié)構(gòu)表征

圖1 楊梅黃酮（a）和楊梅黃酮合氧釩配合物（b）結(jié)構(gòu)

配合物采用KBr壓片法，在400～4000cm-1范圍內(nèi)炒采集楊梅黃酮及楊梅黃酮合氧釩配合物的紅外光譜；取一定量楊梅黃酮及楊梅黃酮合氧釩配合物溶于丙酮中，溶液濃度在10-4mol/L以下，在200～500 nm范圍內(nèi)掃描。

1.4 楊梅黃酮合氧釩對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其催化動力學(xué)研究

取20μL 2mg/mL楊梅黃酮合氧釩，加入pNPG（0.116 mol/L）20μL，混勻，37℃水浴恒溫60min，反應(yīng)液中再加入α-葡萄糖苷酶0.1U/mL 50μL，37℃水浴恒溫30min，最后加入1mol/L的Na2CO3溶液100μL，終止反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀在405nm波長下測定OD值?？瞻捉M磷酸鹽PBS緩沖液(0.2mol/mL，pH6.8)代替酶液，對照組以二甲基亞砜代替樣液，阿卡波糖為陽性參照物，根據(jù)公式計算各濃度下α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制率。[11]

式中：A為樣品的吸光值；A’為樣品空白吸光值;A0為對照組吸光值；A0’為對照組空白吸光值。

采用Line weaver-Burk曲線作圖法判斷楊梅黃酮合氧釩對α-葡萄糖苷酶抑制類型，固定α-葡萄糖苷酶溶液濃度，分別改變pNPG濃度（2.5、5、7.5、10μmol/mL）及楊梅黃酮合氧釩水溶液濃度（0.8、1.2、1.6 mg/m L），以 1/v對 1/[S]作圖，得到Lineweaver-Burk曲線（見圖6）。[11]

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以（X±s）的形式表示，采用LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅黃酮合氧釩結(jié)構(gòu)表征分析

2.1.1 紅外光譜分析

楊梅黃酮和楊梅黃酮合氧釩的紅外吸收光譜見圖2（a）和2（b）。由圖2（a）和2（b）可知，二者的紅外吸收光譜明顯不同，楊梅黃酮在3410cm-1處峰形尖銳，歸屬為νO-H的伸縮振動，而楊梅黃酮合氧釩在3369cm-1處出現(xiàn)較寬鈍的νO-H吸收峰，且強(qiáng)度增加，原因是楊梅黃酮酚羥基與配位水分子形成氫鍵，使νO-H向低頻移動，且強(qiáng)度增加。在515cm-1出現(xiàn)了配位水的振動吸收，進(jìn)一步佐證了配合物中配位水的存在。楊梅黃酮4號位羰基在1660cm-1處有吸收峰，而楊梅黃酮合氧釩則在1595cm-1處有吸收峰，向低波數(shù)移動了65cm-1，表明配體4號位羰基與釩原子配位成鍵。楊梅黃酮在1200cm-1處出現(xiàn)峰，歸屬為酚羥基νC-O的伸縮振動，楊梅黃酮合氧釩移至1112cm-1，向低波數(shù)移動了88cm-1，原因是楊梅黃酮酚羥基提供電子與釩離子配位；楊梅黃酮合氧釩在614cm-1新出現(xiàn)的峰歸屬為V-O鍵的伸縮振動，進(jìn)一步表明配體與釩陽離子間配位鍵的形成。

圖2 楊梅黃酮(a)和楊梅黃酮合氧釩(b)紅外圖譜

2.1.2 紫外光譜分析

楊梅黃酮和楊梅黃酮合氧釩紫外光譜見圖3（a）和3（b）。楊梅黃酮在200～500nm范圍存在兩個主要紫外吸收帶，最大吸收波長分別為210nm和373nm，而楊梅黃酮氧釩的兩個紫外吸收帶則均向長波方向移動，最大吸收波長分別為238nm和423nm；分別由210nm移至238nm和由373nm移至423nm，且在357.5nm處出現(xiàn)新峰，這表明楊梅黃酮氧釩對楊梅黃酮B環(huán)共軛效應(yīng)增強(qiáng)較大，對A環(huán)的影響相對較小。據(jù)紅外光譜可知，A環(huán)羰基是參與配位的，又從楊梅黃酮的結(jié)構(gòu)式可看出，另一個參與配位的可以是3-羥基，也可以是5-羥基。因3-羥基是與B環(huán)共軛，而5-羥基與A環(huán)共軛，且楊梅黃酮氧釩配合物對B環(huán)共軛效應(yīng)增強(qiáng)較大，因此可判斷是楊梅黃酮的3-羥基而非5-羥基參與配位。

圖3 楊梅黃酮（a）和楊梅黃酮合氧釩(b)紫外圖譜

2.2 楊梅黃酮合氧釩對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其酶催化動力學(xué)特征

由圖4所示，隨著楊梅黃酮合氧釩濃度的增大，其對a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，楊梅黃酮合氧釩濃度為0.4 mg/mL時對a-葡萄糖苷酶的抑制率高，達(dá)到91.91%，是同濃度下陽性對照阿卡波糖抑制率的2.45倍，通過計算得到其IC50為271mg/L.

研究表明天然黃酮類活性成分對α-葡萄糖苷酶活性有顯著抑制作用，[12-13]本研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物楊梅黃酮合氧釩對α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著高于阿卡波糖（p＜0.005）。劉合生等對比了楊梅素、楊梅苷和氯化矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)三者中楊梅苷對α-葡萄糖苷酶的抑制作用最弱，楊梅苷疏水性的降低可能減弱了它與酶的親和力。[14]本研究中合成的楊梅黃酮合氧釩B環(huán)3′4′5′攜帶3個羥基，且是雙核黃酮氧釩配合物，由于共軛效應(yīng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)供電性，同時金屬配位原子的協(xié)同效應(yīng)，亦增強(qiáng)了楊梅黃酮合氧釩對α-葡萄糖苷酶抑制效果。

圖5 楊梅黃酮合氧釩對α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線

對楊梅黃酮合氧釩抑制α-葡萄糖苷酶作用進(jìn)行酶動力學(xué)分析，Lineweaver-Burk曲線結(jié)果表明，當(dāng)楊梅黃酮合氧釩濃度增加時，抑制作用的表觀Km值增大，Vmax不變，說明楊梅黃酮合氧釩對α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于典型的競爭性抑制，其競爭性抑制作用的強(qiáng)弱取決于抑制劑與底物競爭酶的濃度，表明楊梅黃酮合氧釩與α-葡萄糖苷酶的底物pNPG有結(jié)構(gòu)上的相似性，能與pNPG競相爭奪α-葡萄糖苷酶分子上的結(jié)合位點，從而產(chǎn)生酶活性的可逆的抑制作用，而劉合生等研究發(fā)現(xiàn)楊梅苷對α-葡萄糖苷酶的抑制為混合型競爭，可能與楊梅苷3號位碳原子形成鼠李糖苷有關(guān)。[14]

3 結(jié) 論

本研究合成了新型有機(jī)氧釩的配合物楊梅黃酮合氧釩，通過紅外光譜、紫外光譜對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，楊梅黃酮合氧釩可抑制α-葡萄糖苷酶活性，其抑制率達(dá)95.60%，其對α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于的競爭性抑制，構(gòu)效關(guān)系表明，楊梅黃酮合氧釩A環(huán)含有3個游離羥基,且C環(huán)3號位羥基具有更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，由于含有金屬釩可改善胰島素抵抗，[15]且楊梅黃酮合氧釩能提高釩的溶解性，因此是一種有前景的新型α-葡萄糖苷酶抑制劑。