李曉筱,劉嬋,徐俊雄,王巖巖 伍翔,覃建兵,柳忠玉

(長江大學生命科學學院,湖北荊州 434025)

虎杖是蓼科多年生藥用草本植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.)的干燥根莖，藥用歷史悠久，藥用成分主要包含蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類、鞣質(zhì)及多糖等化合物[1]。經(jīng)研究，虎杖具有抗炎抗菌、保護心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)血液系統(tǒng)、抗腫瘤等多種功能[2]。虎杖藥效成分中的白藜蘆醇、類黃酮等物質(zhì)都經(jīng)由苯丙烷類代謝途徑而來[3,4]。

筆者所在課題組通過RT-PCR和RACE技術(shù)從虎杖中獲得了1個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為PcMYB1，GenBank登錄號為KY495789。經(jīng)生物信息學分析，PcMYB1基因的開放讀碼框長為813bp，編碼270個氨基酸殘基，具有典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進化樹分析表明，PcMYB1與Sg4亞家族的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子有較近的親緣關(guān)系，PcMYB1蛋白的C端區(qū)域具有4個典型的Sg4亞家族的保守序列，分析預(yù)測PcMYB1可能是1個在苯丙烷類代謝中起負調(diào)控作用的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。

近年來研究人員已對多種植物的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子進行了研究并取得了較大的進展[5～10]，但在虎杖中對該類轉(zhuǎn)錄因子基因的研究還很少，該研究擬通過構(gòu)建PcMYB1的植物過表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥以進一步探究虎杖R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子PcMYB1基因的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為擬南芥(Columbia 生態(tài)型)；含有目的基因PcMYB1的1K-5質(zhì)粒、含35S啟動子的P5002質(zhì)粒、大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株EHA105、植物表達載體pCAMBIA 1380均由長江大學生命科學學院分子生物學實驗室保存。

TaqDNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、PstⅠ、BamHⅠ，T4連接酶，卡那霉素(Kanamycin,Kan)，潮霉素(hygromycin,hyg)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購于寶生物大連有限公司，所用引物和測序服務(wù)均由武漢生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1PcMYB1基因植物表達載體構(gòu)建

以含有35S啟動子的P5002質(zhì)粒為模板，以含有目的基因PcMYB1的1K-5質(zhì)粒為模板，設(shè)計特異引物經(jīng)PCR分別擴增虎杖PcMYB1的基因片段與35S啟動子片段，回收純化后分別將其克隆至pUC19的BamHⅠ/PstⅠ位點與PstⅠ/HindⅢ位點，得到重組載體pUC19-35S-PcMYB1，其間構(gòu)建的中間載體為pUC19-35S。對重組載體pUC19-35S-PcMYB1進行BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，獲得包含35S啟動子和PcMYB1基因的酶切片段，回收純化后將該片段克隆至植物表達載體pCAMBIA 1380的BamHⅠ/HindⅢ位點，獲得植物過表達載體pCAMBIA 1380-35S-PcMYB1。構(gòu)建過程如圖1所示。

圖1 PcMYB1A1380-35S-PcMYB1表達載體構(gòu)建示意圖

該載體構(gòu)建過程中，PCR擴增所需的基因特異引物序列見表1。常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳后進行試劑盒回收；酶切反應(yīng)條件為37℃，1.5h；連接反應(yīng)體系20μL，在T4連接酶的作用下進行連接，條件為22℃ 1h、65℃ 10min。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)相應(yīng)抗生素篩選獲得陽性單克隆菌落，抽取質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切初步鑒定后送至測序。

表1 基因特異引物序列

1.2.2PcMYB1基因的擬南芥轉(zhuǎn)化

正確構(gòu)建的PcMYB1基因過表達載體pCAMBIA 1380-35S-PcMYB1通過電擊轉(zhuǎn)化法進入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，經(jīng)篩選挑取陽性克隆后進行PCR及酶切驗證。以攜帶重組質(zhì)粒pCAMBIA 1380-35S-PcMYB1的農(nóng)桿菌菌液為工作液，以花絮浸染法[11]轉(zhuǎn)化即將開花的擬南芥野生植株。

1.2.3擬南芥轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定

T0代擬南芥種子經(jīng)消毒后點在含潮霉素(濃度為25mg/L)的MS培養(yǎng)基上進行篩選，挑選在培養(yǎng)基上正常生根成長的兩周擬南芥幼苗進行移栽，抽提6周齡大小的擬南芥植株的基因組DNA，設(shè)計潮霉素基因特異引物進行PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 PcMYB1基因的植物過量表達載體構(gòu)建

35S啟動子大小為536bp，PcMYB1開放閱讀框(ORF)序列長813bp，總的插入片段大小為1349bp。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和PstⅠ酶切的重組質(zhì)粒pUC19-35S(圖2a)；用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和HindⅢ酶切的重組質(zhì)粒pUC1935S-PcMYB1(圖2b)；用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA1380-35S-PcMYB1(圖2c)，酶切結(jié)果均與預(yù)期相同，初步證明載體構(gòu)建成功。經(jīng)過測序驗證序列正確，即成功構(gòu)建了帶有35S啟動子和PcMYB1基因的植物過量表達載體pCAMBIA1380-35S-PcMYB1。

1.BamHⅠ和PstⅠ酶切的pUC19-35S;2.PstⅠ/HindⅢ酶切的pUC1935S-PcMYB1; 3.BamHⅠ/HindⅢ酶切的pCAMBIA1380-35S-PcMYB1；M:DNA分子量標準DL2000 Marker圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

圖3 擬南芥各個時期的生長情況

圖4 潮霉素抗性篩選擬南芥株系

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，以攜帶重組質(zhì)粒pCAMBIA1380-35S-PcMYB1的農(nóng)桿菌菌液為工作液，用花絮浸染法轉(zhuǎn)化即將開花的擬南芥植株(大約6～7周齡)，擬南芥各個時期的生長記錄如圖3所示。

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的潮霉素篩選與PCR鑒定

收集T0代種子(約8700粒)，在含有25mg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基平板上篩選，得到10株抗性幼苗，初步得出擬南芥陽性轉(zhuǎn)化率為0.11%。在潮霉素抗性培養(yǎng)基上生長約2周的擬南芥幼苗，抗性株系能夠正常生長出真葉，幼苗葉片呈正常綠色，并正常生根。而非抗性株系長到兩片葉子便停止生長，不能生長出真葉，并且幼苗在生長的過程中葉片逐漸變黃變白，且不能正常生根，最后直至死亡(圖4)。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

將具有潮霉素抗性的擬南芥2周齡幼苗移栽至盆土中，生長約4周后提取擬南芥葉片基因組DNA，設(shè)計潮霉素基因特異引物進行PCR鑒定。以植物過表達載體pCAMBIA1380-35S-PcMYB1質(zhì)粒作為陽性對照，所檢測的擬南芥抗性株系都能擴增出大小約500bp的條帶，而陰性對照的擬南芥野生型株系未能擴增出任何條帶(圖5)。潮霉素基因PCR擴增結(jié)果初步證明PcMYB1基因已經(jīng)整合入擬南芥植株的基因組中。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，C2基序pdLNL[D/E]LXI[G/S]為典型的抑制結(jié)構(gòu)域，具有轉(zhuǎn)錄抑制活性[3]。含有C2基序的MYB轉(zhuǎn)錄因子通常在苯丙烷類代謝途徑中起負調(diào)控作用，大部分調(diào)控類黃酮合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子都是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[12]，如，荷花中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子NnMYB4的C端具有C2基序pdLNL[D/E]LXI[G/S]，在擬南芥中表達后，木質(zhì)素含量明顯降低[13]；銀杏中負調(diào)控蛋白GbMYBF2抑制花青素及黃酮類物質(zhì)的的生成[7]；EgMYB1[8,9]、ZmMYB31[14]等在生物合成中對木質(zhì)素的合成起抑制作用。目前，對虎杖苯丙烷類代謝中MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能知之甚少，該研究構(gòu)建了PcMYB1基因的植物過量表達載體，利用花絮浸染法成功將其轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，為擬南芥轉(zhuǎn)化純合株系的篩選以及功能驗證的研究奠定了基礎(chǔ)。在擬南芥轉(zhuǎn)化研究方面，利用花絮浸染法侵染擬南芥來獲得陽性植物株系并不十分高效，研究初步得出擬南芥陽性轉(zhuǎn)化率為0.11%，本研究所建立噴霧法轉(zhuǎn)化擬南芥的體系也在摸索當中，希望借此建立一種更高效的基因轉(zhuǎn)化方法。