貢常委，秦旖曼，屈勁松，王學(xué)貴

?

四川省草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性測(cè)定及其機(jī)制

貢常委，秦旖曼，屈勁松，王學(xué)貴

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/無公害農(nóng)藥研究實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

【目的】灰霉病是草莓生產(chǎn)過程中的一種重要病害，嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)。論文旨在明確四川省草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性頻率以及抗性機(jī)制，為草莓灰霉病的藥劑防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā?016—2017年從四川成都、德陽、眉山、樂山及雅安等地采集草莓灰霉病樣本，并分離純化得到188株草莓灰霉病菌菌株。采用區(qū)分計(jì)量法測(cè)定188株灰霉病菌對(duì)咯菌腈的敏感性水平，采用菌絲生長速率抑制法測(cè)定咯菌腈對(duì)代表性菌株的毒力和滲透壓敏感性，采用甘油銅比色法測(cè)定經(jīng)咯菌腈處理的抗性菌株和敏感菌株甘油含量，采用分段測(cè)序?qū)剐跃旰兔舾芯辎笮徒M氨酸激酶基因（BC1G_00374）擴(kuò)增測(cè)序，采用Swissmodle和I-TASSER預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)突變對(duì)BOS1的結(jié)構(gòu)影響?！窘Y(jié)果】188株灰霉病菌菌株中有8株表現(xiàn)為高抗，9株為中抗，43株為低抗，其余表現(xiàn)為敏感；咯菌腈對(duì)代表性菌株的EC50介于0.03—0.62 μg·mL-1，代表性菌株的抗性倍數(shù)范圍為2.2—45.9。NaCl濃度在1.25—10 g·L-1可刺激敏感菌株生長，濃度在1.25—20 g·L-1范圍可刺激抗性菌株生長，但＞40 g·L-1時(shí)則抑制菌絲生長，尤其對(duì)抗性菌株，抗性越高抑制作用越強(qiáng)；在正常條件下各代表性菌株甘油含量介于0.0025—0.0148 μg·mL-1，且菌株的甘油含量與咯菌腈抗性沒有明顯的關(guān)聯(lián)性，但在使用咯菌腈處理(0.1 μg·mL-1)抗性菌株和敏感菌株后，甘油含量均上升，且抗性菌株甘油含量上升幅度明顯低于敏感菌株。低抗菌株YAHY-13、CDCZ-2以及中抗菌株CDCZ-42在TAR和HAMP區(qū)域均發(fā)生突變，中抗菌株CDCZ-20和高抗菌株MYFC-10、CDCZ-43在TAR和REC區(qū)域均有突變，但CDCZ-20菌株在TAR區(qū)域位點(diǎn)是I365N，而兩株高抗菌株在TAR區(qū)域位點(diǎn)是I365S。不同突變位置對(duì)BOS1區(qū)域結(jié)構(gòu)有不同程度的影響，其中F127S、I365N、I365S、V1136I、A1259T均處于BOS1區(qū)域結(jié)構(gòu)的無規(guī)則卷曲，但TAR區(qū)域I365N和I365S使區(qū)域結(jié)構(gòu)無規(guī)則卷曲發(fā)生整體偏移?！窘Y(jié)論】四川省已有部分地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈產(chǎn)生了抗性；相比敏感菌株，田間抗性菌株對(duì)滲透壓的耐受能力增加，但當(dāng)濃度超過耐受范圍后對(duì)滲透脅迫高度敏感，藥劑脅迫下田間抗性菌株甘油含量增加量顯著小于敏感菌株；組氨酸激酶突變的位置和方式與灰霉病菌菌株對(duì)咯菌腈的抗性水平存在必然聯(lián)系。

灰霉病菌；咯菌腈；抗藥性；滲透壓；甘油含量；

0 引言

【研究意義】灰霉病（主要致病菌為灰葡萄孢，）危害多種作物，現(xiàn)已被列入世界十大重要作物真菌病害[1-2]?；颐共【闹鲝V泛，可侵染200多種植物[3]，不僅在生長期通過植物表面或植物傷口侵染，還會(huì)在蔬菜和水果的運(yùn)輸、儲(chǔ)藏期進(jìn)行危害，影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。由于該病原菌具有繁殖速度快、變異頻率高等特點(diǎn)，在殺菌劑長期選擇壓力下，極易造成抗藥性的暴發(fā)，且由于菌株多抗性特點(diǎn)，導(dǎo)致灰霉病的防治十分困難[4-5]。咯菌腈（fludioxonil）是瑞士先正達(dá)公司開發(fā)的一種新型苯基吡咯類殺菌劑，對(duì)灰霉病菌有特效，抑制孢子萌發(fā)的同時(shí)也能夠抑制菌絲體的生長[6]。檢測(cè)灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性頻率以及抗性機(jī)制，可為灰霉病的藥劑防治提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】防治灰霉病的化學(xué)藥劑主要有7大類：苯并咪唑類、N-苯基氨基甲酸酯類、二甲酰亞胺類、苯胺基嘧啶類、甲氧基丙烯酸酯類、琥珀酸脫氫酶抑制劑類（SDHIs）、苯基吡咯類。苯并咪唑類殺菌劑是防治灰霉病歷史最長的一類藥劑，但引入我國后不久就出現(xiàn)了抗性報(bào)道[7]；二甲酰亞胺類殺菌劑在使用幾年后便在田間發(fā)現(xiàn)了高抗菌株[8]；張瑋等[9]研究發(fā)現(xiàn)，我國葡萄灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗性頻率為22.22%—62.50%，且以高抗和中抗菌株為主，高抗菌株頻率達(dá)44.23%?？┚鏆⒕V廣，毒性低，可用于防治由擔(dān)子菌、子囊菌、半知菌等引起的多種植物病害[6]。徐建強(qiáng)等[10]研究表明，咯菌腈對(duì)牡丹的4種葉片真菌，即牡丹黑斑病菌（）、黃斑病菌（）、腔孢葉斑病菌（）和葉霉病菌（）的菌絲生長、孢子萌發(fā)、芽管伸長及產(chǎn)孢均具有很強(qiáng)的抑制活性。咯菌腈作用靶標(biāo)為Ⅲ型組氨酸激酶，可抑制Ⅲ型組氨酸激酶磷酸化，激活HOG-MAPK途徑，然后由它磷酸化下游目標(biāo)Ypd1，最終可合成大量的甘油致使細(xì)胞死亡[11-12]；灰霉病菌Ⅲ型組氨酸激酶BOS1通過基因敲除的方法被克隆鑒定，敲除突變體對(duì)苯基吡咯類殺菌劑的抗性顯著提升[13]；為了揭示對(duì)HOG-MAPK途徑的具體功能，SEGMüLLER等構(gòu)建了和（Hog1-like基因）雙突變體，BOS1負(fù)調(diào)控SAK1磷酸化，參與對(duì)甘油合成和滲透壓的調(diào)節(jié)功能；同時(shí)BOS1獨(dú)立于HOG-MAPK途徑，調(diào)節(jié)殺菌劑敏感性、在高滲條件下的適應(yīng)性[14-15]。在典型的Ⅲ型組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的N-末端有5—6個(gè)重復(fù)HAMP結(jié)構(gòu)域[16]，HAMP亞基含有兩個(gè)螺旋，由約14個(gè)柔性殘基連接，每一個(gè)螺旋都由典型的七肽重復(fù)序列（A-G）組成，在A和D的位置具有疏水殘基[17]，根據(jù)NCBI對(duì)灰霉病菌B05.10菌株BOS1的注釋，它除了具有5個(gè)重復(fù)的HAMP結(jié)構(gòu)域外，還具有RAP、TAR、HisKA、HATPase_c、G-X-G motif、REC等結(jié)構(gòu)。目前有關(guān)咯菌腈藥劑的抗性報(bào)道較少，在國外部分地區(qū)有低、中水平抗性的報(bào)道，Vignutelli等[18]在法國監(jiān)測(cè)到一株低抗菌株，F(xiàn)ernándezortu?o等[19]在美國弗吉尼亞州分離得到一株低抗菌株，這也是美國在咯菌腈生產(chǎn)并使用10年后首次監(jiān)測(cè)到咯菌腈的抗性菌株?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國內(nèi)外雖陸續(xù)有咯菌腈抗性菌株的報(bào)道，但對(duì)灰霉病菌咯菌腈抗性機(jī)制研究相對(duì)較少，且不同區(qū)域使用藥劑類型及使用頻率亦有差異，導(dǎo)致灰霉病菌對(duì)其產(chǎn)生抗性機(jī)制的原因可能有所不同；本文通過測(cè)定四川省草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性水平和頻率，分析滲透壓、甘油含量以及組氨酸激酶BOS1突變的位置和方式與咯菌腈抗性水平之間的關(guān)系，從而探索灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確四川省草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈抗性頻率、抗性水平和部分生理指標(biāo)，通過抗性菌株靶標(biāo)基因擴(kuò)增測(cè)序，明確四川省草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈抗性機(jī)制，為科學(xué)使用咯菌腈提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 采用課題組2016—2017年在四川省草莓主產(chǎn)區(qū)采集、分離的草莓灰霉病菌菌株（表1）。

表1 四川省草莓灰霉病菌供試菌株

1.1.2 供試藥劑與儀器 95%咯菌腈原藥（山東億嘉生物科技有限公司）；甘油、氫氧化鈉、氯化鈉、瓊脂粉等化學(xué)試劑均購置于成都浩搏優(yōu)科技有限公司，DNA提取試劑盒購置于上海生工生物工程股份有限公司（上海生工）；引物合成和測(cè)序均在上海生工完成。

SHP-250恒溫培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；SW-OJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；UV3000紫外分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）；D37520離心機(jī)（美國科峻儀器公司）；Powerpac 200型電泳儀（Bio-rad公司）；C1000 PCR擴(kuò)增儀（Bio-rad公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性水平檢測(cè) 按照區(qū)分劑量法[20]，對(duì)2016—2017年采集于四川省的188株草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，即將采集并分離的菌株分別接種在含0.1、0.5、1 μg·mL-13種咯菌腈濃度的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。將能在含0.1、0.5、1 μg·mL-1咯菌腈濃度的PDA培養(yǎng)基生長菌絲的菌株視為高抗菌株，將能在含0.1、0.5 μg·mL-1咯菌腈濃度的PDA培養(yǎng)基生長菌絲，而不能在1 μg·mL-1咯菌腈濃度的培養(yǎng)基上生長菌絲的菌株視為中抗菌株，將能在含0.1 μg·mL-1咯菌腈濃度的PDA培養(yǎng)基生長菌絲，而不能在0.5和1 μg·mL-1咯菌腈濃度的培養(yǎng)基上生長菌絲菌株視為低抗菌株，將不能在含有咯菌腈的培養(yǎng)基上生長菌絲的菌株視為敏感菌株，統(tǒng)計(jì)抗性和敏感菌株的發(fā)生頻率，并對(duì)抗性類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[21]。

1.2.2 咯菌腈抗性菌株毒力測(cè)定 采用菌絲生長速率法[22]。將原藥分別配制成0.025、0.05、0.1、0.5、1 μg·mL-15個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，均勻混入PDA培養(yǎng)基中，然后將供試菌原接種于含毒培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，在22℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d后，采用“十字交叉法”測(cè)定菌落直徑，根據(jù)菌落直徑的平均值計(jì)算咯菌腈對(duì)菌絲生長的抑制率。

抑制率=（對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

根據(jù)抑制率查表得到相對(duì)應(yīng)的機(jī)率值，將藥劑濃度轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值。以機(jī)率值為縱坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，得到毒力回歸方程，根據(jù)毒力回歸方程，計(jì)算殺菌劑的有效中濃度（EC50），參考敏感基線EC50=0.0135 μg·mL-1[23]，計(jì)算抗性倍數(shù)，抗性倍數(shù)=抗性菌株EC50/敏感菌株EC50。

1.2.3 咯菌腈抗性及敏感菌株滲透壓敏感性測(cè)定 采用菌絲生長速率法[22]。將NaCl溶液配制為0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 g·L-1，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，均勻混入PDA培養(yǎng)基中，然后將供試菌原接種于含NaCl的培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，在22℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，采用“十字交叉法”測(cè)定菌落直徑，并計(jì)算不同濃度下的菌絲生長抑制率，計(jì)算公式參考1.2.2。

1.2.4 咯菌腈抗性及敏感菌株甘油含量測(cè)定 采用甘油銅比色法[24]。標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：在50 mL的錐形瓶中依次加入0.05 g·mL-1的CuSO4溶液1 mL，0.05 g·mL-1的NaOH溶液3.5 mL，再分別加入10 mL濃度為0.0025、0.003、0.004、0.005、0.006、0.008、0.01 g·mL-1的甘油，振蕩反應(yīng)12 min后，用三層濾紙過濾，在630 nm下測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)并利用Excel 2016軟件求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將敏感菌株和抗性菌株分別接種于液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌種接種6瓶，每瓶接種5個(gè)菌餅，25℃，175 r/min培養(yǎng)60 h后，每個(gè)菌株取3瓶，加入0.1 μg·mL-1的咯菌腈1 mL，培養(yǎng)4 h后，過濾收集菌絲，用超純水洗凈，濾紙吸干水分并風(fēng)干。每個(gè)樣品取0.5 g菌絲，在研缽中加入20 mL無菌水和少量石英砂，低溫研磨，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，80℃加熱15 min，然后在8 500 r/min下離心10 min，取上清液在630 nm下測(cè)定吸光度。以蒸餾水作為空白對(duì)照。將測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得菌株的甘油含量[25]。

1.2.5 咯菌腈抗性菌株的分子檢測(cè) 灰霉病菌DNA提取：采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒的方法提取灰霉病菌DNA。將新鮮菌株接種到含有100 mL PDA培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中（每瓶5—7個(gè)菌餅），然后置于搖床（25℃、120 r/min）振蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)4 d后的菌絲取出后，放置4層紗布于布氏漏斗上，在無菌條件下抽干菌絲上的培養(yǎng)液；取50—100 mg菌絲用液氮研磨成粉末，加入到1.5 mL離心管中。加入400 μL Buffer Digestion和4 μL巰基乙醇，振蕩混勻。將離心管置于65℃水浴鍋中水浴1 h至細(xì)胞完全裂解，每10 min顛倒混勻一次；加入200 μL Buffer PF，充分顛倒混勻，-20℃冰箱放置5 min；室溫10 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中；加入等體積的異丙醇，顛倒5—8次使之充分混勻，室溫放置2—3 min。室溫10 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入1 mL 75%乙醇，顛倒漂洗1—3 min，室溫10 000 r/min離心2 min，棄上清液，重復(fù)步驟1次；開蓋，室溫倒置5—10 min至殘留的乙醇完全揮發(fā)；得到的DNA用50 μL TE Buffer溶解，置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

靶標(biāo)基因擴(kuò)增[20]：根據(jù)殺菌劑的靶標(biāo)基因（BC1G_00374）序列設(shè)計(jì)引物，采用50 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行分段擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序如下：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；16℃2 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳（120 V，15 min），EB染色，在凝膠成像儀下觀察條帶大小。引物序列見表2，擴(kuò)增反應(yīng)體系：Template DNA（100 ng·μL-1）1.0 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，Dntp Mix（10 mmol·L-1each）2.0 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U·μL-1）1.0 μL，BF（10 pmol·L-1）2.0 μL，BR（10 pmol·L-1）2.0 μL，ddH2O 17 μL。

靶標(biāo)基因測(cè)序分析：將PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)得菌株基因序列用DNAMAN序列分析軟件進(jìn)行拼接并翻譯氨基酸序列，采用Swissmodle（https://swissmodel. expasy.org/）和I-TASSER（https://zhanglab.cmmb.med. umich.edu/ I-TASSER/）對(duì)BOS1的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；采用ENDscript 3.0[26]對(duì)比對(duì)代表性菌株BOS1的氨基酸序列以及空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。

表2 靶標(biāo)基因BOS1分段擴(kuò)增所需引物

2 結(jié)果

2.1 草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈抗性頻率測(cè)定

采用區(qū)分計(jì)量法對(duì)2016—2017年采集于四川省不同地區(qū)的188株草莓灰霉病菌進(jìn)行抗性頻率測(cè)定，結(jié)果見表3。在188株菌株中，高抗菌株有8株（4.25%），中抗菌株有9株（4.78%），低抗菌株有43株（22.87%），敏感菌株128株（68.08%）；其中綿陽涪城區(qū)的高抗菌株比例最大（23.53%），而成都崇州、成都彭州、德陽廣漢、眉山仁壽的中抗菌株比例也分別達(dá)到7.84%、10.00%、9.09%和7.69%；敏感菌株比例高于80%的僅有成都雙流（88.89%）和眉山東坡區(qū)（88.88%）。

2.2 咯菌腈對(duì)草莓灰霉病菌毒力測(cè)定

基于草莓灰霉病菌區(qū)分計(jì)量法檢測(cè)的結(jié)果，從其中篩選敏感菌株CDPZ-8和CDCZ-11，低抗菌株CDCZ-2和YAHY-13，中抗菌株CDCZ-42和CDCZ-20，高抗菌株MYFC-10和CDCZ-43進(jìn)行了毒力測(cè)定（表4）。結(jié)果表明，低抗菌株及中抗菌株，抗性倍數(shù)均＜10，高抗菌株抗性倍數(shù)＞10。其中敏感菌株的EC50在0.03—0.05 μg·mL-1，抗性倍數(shù)為2.2—3.7；低抗菌株和中抗菌株EC50在0.08—0.11 μg·mL-1，抗性倍數(shù)為5.9—8.1，毒力結(jié)果相差不大；高抗菌株EC50在0.43—0.62 μg·mL-1，抗性倍數(shù)為31.9—45.9。

表3 四川省不同采集地點(diǎn)的草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性水平

表4 咯菌腈對(duì)抗性及敏感草莓灰霉病菌菌株毒力

2.3 咯菌腈抗性及敏感菌株滲透壓敏感性測(cè)定

將篩選菌株接種至分別含0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 g·L-1NaCl溶液的PDA中培養(yǎng)，結(jié)果見圖1。敏感菌株在1.25—10 g·L-1NaCl濃度范圍內(nèi)可刺激生長，抗性菌株在1.25—20 g·L-1NaCl濃度范圍內(nèi)刺激生長（MYFC-10菌株除外），在高濃度40 g·L-1以上生長被抑制，在80 g·L-1NaCl溶液的PDA中培養(yǎng)抗性越高的菌株其抑制率越高。

圖1 代表性菌株在不同濃度NaCl下的抑制率

2.4 咯菌腈抗性及敏感菌株的甘油含量測(cè)定

甘油銅比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線：=5.427+0.0012，2=0.9929，線性相關(guān)性良好。由表5可知，在正常條件下各菌株之間甘油含量范圍是0.0025—0.0148 μg·mL-1，且與對(duì)咯菌腈抗性沒有明顯的相關(guān)性，在加入0.1 μg·mL-1的咯菌腈1 mL處理4 h后，敏感菌株甘油含量明顯上升，抗性菌株甘油含量雖然增加，但變化不明顯，增加幅度低于敏感菌株。結(jié)果表明，咯菌腈抗性菌株在有藥劑脅迫的作用下，甘油的合成受到了影響，且菌株抗性越高，抑制作用越明顯。

表5 咯菌腈對(duì)代表性菌株甘油含量影響

表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著（＜0.05）

Data are mean±SE. Different lowercases in the same column indicate significant difference at＜0.05 level

2.5 代表性菌株Ⅲ型組氨酸激酶基因BOS1測(cè)序

將待測(cè)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并提取DNA，對(duì)雙組份組氨酸激酶基因（Broad Institute登錄號(hào)：BC1G_00374）進(jìn)行測(cè)序。由圖2可知，不同突變位置對(duì)BOS1區(qū)域結(jié)構(gòu)有不同程度的影響，F(xiàn)127S、I365N、I365S、V1136I、A1259T均處于BOS1區(qū)域結(jié)構(gòu)的無規(guī)則卷曲，但只有TAR區(qū)域I365N和I365S與野生型區(qū)域結(jié)構(gòu)有很大差異，其中I365N使365 aa附近下部無規(guī)則卷曲發(fā)生整體偏移，而I365S使365 aa附近下部和上部無規(guī)則卷曲都發(fā)生整體偏移；V287G處于螺旋，且兩者螺旋結(jié)構(gòu)差異不大；將拼接后的DNA序列翻譯氨基酸序列，然后進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在6個(gè)待測(cè)菌株中有5種突變類型，3種變異菌株。所有抗性菌株均在TAR區(qū)域有突變，且低抗菌株YAHY-13、CDCZ-2以及中抗菌株CDCZ-42在HAMP區(qū)域亦發(fā)生突變；而中抗菌株CDCZ-20和高抗菌株MYFC-10和CDCZ-43在TAR、REC區(qū)域均有突變，但CDCZ-20菌株在TAR區(qū)域突變位點(diǎn)是I365N，而兩株高抗菌株突變位點(diǎn)是I365S（圖3、表6）。

3 討論

同種病害在不同區(qū)域?qū)ν环N藥劑表現(xiàn)出不同的抗性頻率和水平，與藥劑使用歷史和頻率有關(guān)。本研究表明，四川省多個(gè)地區(qū)的草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈已產(chǎn)生不同程度的抗性，其抗性頻率為31.92%，其中綿陽涪城區(qū)的高抗菌株比例最大，成都崇州、成都彭州、德陽廣漢、眉山仁壽的中抗菌株比例亦達(dá)到7%以上，而成都雙流和眉山東坡區(qū)的敏感菌株比例在80%以上。1984年，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司通過修飾硝吡咯菌素合成咯菌腈，1996年被美國等國家允許登記使用，Li等[27]對(duì)在2009—2012年間從美國、德國采集的11株接觸過咯菌腈的灰霉病菌菌株進(jìn)行抗性監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)2株低抗菌株（EC50范圍為0.16—0.26 μg·mL-1），2株中抗菌株（EC50范圍為0.32—0.38 μg·mL-1）；Liu等[28]從河南不同地點(diǎn)采集分離了274株番茄灰霉病菌，敏感性測(cè)定發(fā)現(xiàn)這些菌株對(duì)咯菌腈EC50在0.0033—0.0415 μg·mL-1（平均值為0.005 μg·mL-1），并通過對(duì)敏感野生型菌株用咯菌腈持續(xù)培養(yǎng)，獲得3個(gè)咯菌腈抗性突變株；禾麗菲等[29]2016年從山東濟(jì)南、泰安、聊城、濰坊、萊蕪及淄博等地分離了126株番茄葉霉病菌，采用菌絲生長速率法測(cè)定這些菌株的敏感基線，發(fā)現(xiàn)敏感基線上升至0.64 μg·mL-1；Sang等[30]在2015—2017年間從施用咯菌腈防治灰霉病的浙江部分區(qū)域草莓灰霉病果和病桿上分離了242株菌株，采用區(qū)分劑量法發(fā)現(xiàn)3株高抗菌株和13株低抗菌株。由此可見，病原菌在咯菌腈的長期選擇壓力下會(huì)導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生。

表6 代表性菌株Ⅲ型組氨酸激酶基因BOS1測(cè)序結(jié)果

綠色Green：沒有突變位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)Structure without mutation site；紅色red：突變位點(diǎn)結(jié)構(gòu)Structure of mutation site；1、3、5、8、10：野生型BOS1蛋白在125—233、267—347、289—628、1111—1228、1229—1310 aa區(qū)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)Tertiary structure of wild type BOS1 protein in 125-233, 267-347, 289-628, 1111-1228, 1229-1310 aa regions；2：BOS1蛋白F127S在125—233 aa的三級(jí)結(jié)構(gòu)Tertiary structure of BOS1 proteinF127S in 125-233 aa；4：BOS1蛋白V287G在267—347 aa的三級(jí)結(jié)構(gòu)Tertiary structure of BOS1 proteinV287G in 267-347 aa；6、7：BOS1蛋白I365N及BOS1蛋白I365S在289—628 aa的三級(jí)結(jié)構(gòu)Tertiary structure of BOS1 proteinI365N and BOS1 proteinI365S in 289-628 aa；9：BOS1蛋白V1136I在1111—1228 aa的三級(jí)結(jié)構(gòu)Tertiary structure of BOS1 proteinV1136I in 1111-1228 aa；11：BOS1蛋白A1259T在1229—1310 aa的三級(jí)結(jié)構(gòu)Tertiary structure of BOS1 proteinA1259T in 1229-1310 aa

圖3 BOS1氨基酸序列對(duì)比

本研究發(fā)現(xiàn)，在高滲作用下，與敏感菌株相比田間抗性菌株對(duì)滲透壓的耐受能力增加，但是當(dāng)濃度超過耐受范圍后對(duì)滲透脅迫高度敏感，菌株抗性越高越敏感，抑制率越高；在藥劑脅迫作用下，抗性菌株產(chǎn)生甘油增加量顯著低于敏感菌株，且抗性越強(qiáng)，甘油增加量越少；這與Ren等研究結(jié)果一致[31]。LI等[32]也發(fā)現(xiàn)與敏感菌核病菌菌株相比，藥劑篩選、化學(xué)誘變及紫外誘變的抗性菌株對(duì)氯化鈉和葡萄糖形成的高滲透壓均敏感；Zhang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，粗糙脈孢菌（OsS）突變體對(duì)高滲透壓敏感，不能在含4% NaCl的培養(yǎng)基上生長，但OS突變體對(duì)苯吡咯類殺菌劑表現(xiàn)抗性；隨后研究發(fā)現(xiàn)OsS編碼一個(gè)與釀酒酵母HOG1同源絲裂原活化蛋白（MAP）激酶，突變體阻礙甘油在細(xì)胞內(nèi)的積累從而導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生；Kojima等[34]通過基因缺失突變的方法，敲除HOG1后發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢對(duì)咯菌腈的抗性增加；在釀酒酵母中，滲透感應(yīng)蛋白組氨酸激酶Slnl通過磷酸傳遞到Y(jié)PD1，響應(yīng)調(diào)控蛋白Sskl，從而對(duì)HOG1途徑起負(fù)調(diào)控作用，不會(huì)產(chǎn)生大量甘油；但在高滲作用下，Slnl的活性暫時(shí)受到抑制，引發(fā)HOG1的途徑激活，并且表達(dá)滲透響應(yīng)基因，產(chǎn)生大量的甘油，而細(xì)胞是通過甘油的合成來平衡細(xì)胞內(nèi)外的壓強(qiáng)以維持正常生長[35-36]。

咯菌腈的作用靶標(biāo)為Ⅲ型雙組分組氨酸激酶，是釀酒酵母Slnl同源基因，通過抑制Ⅲ型組氨酸激酶的活性，產(chǎn)生大量的甘油使真菌細(xì)胞脹裂死亡；咯菌腈抗性菌株因?yàn)棰笮徒M氨酸激酶基因的突變，使咯菌腈與靶標(biāo)Ⅲ型組氨酸激酶親和性下降而正常表達(dá)，從而維持細(xì)胞形態(tài)[16]。本文通過對(duì)咯菌腈的靶標(biāo)基因（BC1G_00374）測(cè)序，發(fā)現(xiàn)四川省的低抗及中抗菌株各一株在HAMP區(qū)域發(fā)生突變，BOS1的三維結(jié)構(gòu)由螺旋和折疊組成跨膜結(jié)構(gòu)，高抗菌株均在C端存在突變，敏感菌株和低抗菌株（CDCZ-2除外）在此位置不存在突變；CDCZ-2除了此位置的突變，還存在N段V287G的突變，另一株低抗菌株也存在N段V287G的突變；因此突變的位置以及方式與灰霉病菌菌株對(duì)咯菌腈的抗性水平存在必然的聯(lián)系。Ren等[31]發(fā)現(xiàn)田間BOS1G311R、BOS1G265D、BOS1N609T菌株以及BOS1G545E對(duì)咯菌腈達(dá)到高抗水平；Sang等[30]發(fā)現(xiàn)田間BOS1F127S, I365N, S426P、BOS1G538R, A1259T、BOS1R319K, V336M, D337N, V346I, A350S, Q369P, N373S菌株以及BOS1G262S, Q369P, N373S對(duì)咯菌腈均達(dá)到高抗水平，采用分子模擬對(duì)接評(píng)價(jià)不同突變對(duì)BOS1空間結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)這些BOS1突變體與咯菌腈的親和力比野生型BOS1親和力顯著降低；Fillinger等[37]利用HAMP結(jié)構(gòu)建模發(fā)現(xiàn)BOS1的HAMP結(jié)構(gòu)域中疏水殘基的置換能夠改變HAMP的螺旋結(jié)構(gòu)，從而可能終止信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；氨基酸殘基E529、T581或E692的突變加強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，而不影響HAMP的螺旋結(jié)構(gòu)。因此，下一步可采用Surflex-Dock分子模擬[38]對(duì)接技術(shù)進(jìn)行模擬或者評(píng)估本研究中所得抗性菌株BOS1與咯菌腈親和性，明確其抗性機(jī)制。

2016年，尚巖[39]報(bào)道四川、重慶、云南、湖北的15個(gè)地區(qū)桃、櫻桃的灰霉病菌對(duì)咯菌腈抗性頻率為0，由于咯菌腈與多菌靈、乙霉威、腐霉利、嘧霉胺和啶酰菌胺之間均不存在交互抗性[40]，可考慮與其他類型殺菌劑混用、交替輪換等方法來防治灰霉病，減緩抗性菌株產(chǎn)生的頻率，做到合理、科學(xué)用藥。

4 結(jié)論

四川省部分地區(qū)草莓灰霉病菌已對(duì)咯菌腈產(chǎn)生了抗性；與敏感菌株相比，田間抗性菌株對(duì)滲透壓的耐受能力增加，但當(dāng)濃度超過耐受范圍后對(duì)滲透脅迫高度敏感；在高滲作用下，菌株抗性越高抑制率越高，說明抗性菌株對(duì)高滲敏感；在咯菌腈脅迫作用下，抗性菌株產(chǎn)生甘油增加量顯著低于敏感菌株，且抗性越強(qiáng)，甘油增加量越少；突變的位置及方式與灰霉病菌菌株對(duì)咯菌腈的抗性水平存在必然聯(lián)系。

[1] ROMANAZZI G, FELIZIANI E.(gray mold)// Bautista-Ba?os S.:. Elsevier, 2014: 131-146.

[2] 張國珍, 鐘珊. 草莓灰霉病研究進(jìn)展. 植物保護(hù), 2018, 44(2):1-10.

ZHANG G Z, ZHONG S. Advances in strawberry gray mold., 2018, 44(2): 1-10. (in Chinese)

[3] WILLIAMSON B, TUDZYNSKI B, TUDZYNSKI P, VAN KAN J A.: the cause of grey mould disease., 2007, 8(5): 561-580.

[4] MYRESIOTIS C K, KARAOGLANIDIS G S, TZAVELLAKLONARI K. Resistance ofisolates from vegetable crops to anilinopyrimidine, phenylpyrrole, hydroxyanilide, benzimidazole, and dicarboximide fungicides., 2007, 91(4): 407-413.

[5] FERNáNDEZ-ORTU?O D, BRYSON P K, GRABKE A, SCHNABEL G. Monitoring for resistance infrom strawberry to seven chemical classes of fungicides in the eastern United States//. 2013, 103(6): S2.43.

[6] SCHIRRA M, D’AQUINO S, PALMA A, MARCEDDU S, ANGIONI A, CABRAS P, SCHERM B, MIGHELI Q. Residue level, persistence, and storage performance of citrus fruit treated with fludioxonil., 2005, 53(17): 6718-6724.

[7] 喬廣行, 嚴(yán)紅, 么奕清, 黃金寶, 李興紅. 北京地區(qū)番茄灰霉病菌的多重抗藥性檢測(cè). 植物保護(hù), 2011, 37(5): 176-180.

QIAO G H, YAN H, YAO Y Q, HUANG J B, LI X H. Detection of multiple fungicide resistance infrom tomato in Beijing., 2011, 37(5): 176-180. (in Chinese)

[8] BARDAS G A, VELOUKAS T, KOUTITA O, KARAOGLANIDISG S. Multiple resistance offrom kiwifruit to SDHIs, QoIs and fungicides of other chemical groups., 2010, 66(9): 967-973.

[9] 張瑋, 喬廣行, 黃金寶, 王忠躍, 李興紅. 中國葡萄灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性檢測(cè). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(6): 1208-1212.

ZHANG W, QIAO G H, HUANG J B, WANG Z Y, LI X H. Evaluation on resistance of grape gray mold pathogento pyrimethanil in China., 2013, 46(6): 1208-1212. (in Chinese)

[10] 徐建強(qiáng), 平忠良, 劉瑩, 馬世闖, 許道超, 楊嵐, 鄭偉, 劉圣明, 夏彥飛, 林曉民. 咯菌腈對(duì)四種牡丹葉片病原真菌的抑制活性. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(20): 4036-4045.

XU J Q, PING Z L, LIU Y, MA S C, XU D C, YANG L, ZHENG W, LIU S M, XIA Y F, LIN X M. Inhibitory activity of fludioxonil to four pathogenic fungi of peony leaves., 2017, 50(20): 4036-4045. (in Chinese)

[11] FURUKAWA K, RANDHAWA A, KAUR H, MONDAL A K, HOHMANN S. Fungal fludioxonil sensitivity is diminished by a constitutively active form of the group III histidine kinase., 2012, 586(16): 2417-2422.

[12] LAWRY S M, TEBBETS B, KEAN I, STEWART D, HETELLE J, KLEIN B S. Fludioxonil induces Drk1, a fungal group III hybrid histidine kinase, to dephosphorylate its downstream target, Ypd1., 2017, 61(2): e01414-16.

[13] VIAUD M, FILLINGER S, LIU W, POLEPALLI JS, LE PêCHEUR P, KUNDURU AR, LEROUX P, LEGENDRE L. A class III histidine kinase acts as a novel virulence factor in., 2006, 19(9): 1042-1050.

[14] SEGMüLLER N, ELLENDORF U, TUDZYNSKI B, TUDZYNSKI P. BcSAK1, a stress-activated mitogen-activated protein kinase, is involved in vegetative differentiation and pathogenicity in., 2007, 6(2): 211-221.

[15] LIU W, LEROUX P, FILLINGER S. The HOG1-like MAP kinase Sak1 ofis negatively regulated by the upstream histidine kinase Bos1 and is not involved in dicarboximide- and phenylpyrrole-resistance., 2008, 45(7): 1062-1074.

[16] PARKINSON J S. Signaling mechanisms of HAMP domains in chemoreceptors and sensor kinases., 2010, 64: 101-122.

[17] AIROLA M V, WATTS K J, BILWES A M, CRANE B R. Structure of concatenated HAMP domains provides a mechanism for signal transduction., 2010, 18(4): 436-448.

[18] VIGNUTELLI A, HIBER-BODMER M, HIBER U W. Genetic analysis of resistance to the phenylpyrrole fludioxonil and the dicarboximide vinclozolin in()., 2002, 106(3): 329-335.

[19] FERNáNDEZORTU?O D, BRYSON P K, GRABKE A,SCHNABEL GFirst report of fludioxonil resistance infrom a strawberry field in Virginia., 2013, 97(6): 848-849.

[20] 武東霞. 灰葡萄孢菌()對(duì)苯噻菌酯和咯菌睛的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

WU D X. Resistance risk for benzothiostrobin and fludioxonil against[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[21] YOSHIDA H, ANO H, ISHIDA C, TANIGAWA N, KIKUI M, TAKASHIMA T, TSUYUGUCHI I. A study of INH 0.1 microgram/ml resistantstrains assessed by BrothMIC MTB-1 method., 2002, 77(7): 533-535.

[22] 慕立義. 植物化學(xué)保護(hù)研究方法. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1994.

MU L Y.. Beijing: China Agriculture Press, 1994. (in Chinese)

[23] 趙建江, 張小風(fēng), 馬志強(qiáng), 王文橋, 韓秀英. 番茄灰霉病菌對(duì)咯菌腈的敏感基線及其與不同殺菌劑的交互抗性. 農(nóng)藥, 2013, 52(9): 684-685.

ZHAO J J, ZHANG X F, MA Z Q, WANG W Q, HAN X Y. Baseline-sensitivity ofon tomato to fludioxonil and cross-resistance against diverse fungicides., 2013, 52(9): 684-685. (in Chinese)

[24] 仇駿, 王大兵, 黃得慶. 甘油銅比色法測(cè)定水中甘油的含量方法研究. 中國化工貿(mào)易, 2014, 30(6): 140.

QIU J, WANG D B, HUANG D Q. Determination of glycerin in water by glycerol copper colorimetric method., 2014, 30(6): 140. (in Chinese)

[25] Duan Y B, Ge C G, Liu S G, Chen C J, Zhou M G. Effect of phenylpyrrole fungicide fludioxonil on morphological and physiological characteristics of., 2013, 106(1/2): 61-67.

[26] ROBERT X, GOUET P. Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server., 2014, 42(Web Server issue): W320-W324.

[27] LI X, FERNáNDEZ-ORTU?O D, GRABKE A, SCHNABEL G. Resistance to fludioxonil inisolates from blackberry and strawberry., 2014, 104(7): 724-732.

[28] LIU S, HAI F, JIANG J. Sensitivity to fludioxonil ofisolates from tomato in Henan Province of China and characterizations of fludioxonil-resistant mutants., 2017, 165(2): 98-104.

[29] 禾麗菲, 陳樂樂, 肖斌, 趙時(shí)峰, 李秀環(huán), 慕衛(wèi), 劉峰. 番茄葉霉病菌對(duì)咯菌腈敏感基線的建立及田間防治效果評(píng)價(jià). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 51(8): 1475-1483.

HE L F, CHEN L L, XIAO B, ZHAO S F, LI X H, MU W, LIU F. Establishment of sensitivity baseline and evaluation of field control efficacy of fludioxonil against., 2018, 51(8): 1475-1483. (in Chinese)

[30] SANG C, REN W, WANG J, XU C, ZHANG Z H, ZHOU M G, CHEN C J, WANG K. Detection and fitness comparison of target-based highly fludioxonil-resistant isolates of, from strawberry and cucumber in China., 2018, 147: 110-118.

[31] REN W C, SHAO W Y, HAN X, Zhou M G, CHEN C J. Molecular and biochemical characterization of laboratory and field mutants ofresistant to fludioxonil., 2016, 100(7): 1414-1423.

[32] LI J L, WU F C, ZHU F X. Fitness is recovered with the decline of dimethachlon resistance in laboratory-induced mutants ofafter long-term cold storage., 2015, 31(3): 305-309.

[33] ZHANG Y, LAMM R, PILLONEL C, LAM S, XU J R. Osmoregulation and fungicide resistance: theos-2 gene encodes a HOG1 mitogen-activated protein kinase homologue., 2002, 68(2): 532-538.

[34] KOJIMA K, TAKANO Y, YOSHIMI A, TANAKA C, KIKUCHI T, OKUNO T. Fungicide activity through activation of a fungal signalling pathway., 2004, 53(6): 1785-1796.

[35] HOHMANN S. Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts., 2002, 66(2): 300-372.

[36] CHEN R E, THOMER J. Function and regulation in MAPK signaling pathways: lessons learned from the yeast., 2007, 1773(8): 1311-1340.

[37] FILLINGER S, AJOUZ S, NICOT P C, LEROUX P, BARDIN M. Functional and structural comparison of pyrrolnitrin- and iprodione- induced modifications in the class III histidine-kinase Bos1 of., 2012, 7(8): e42520.

[38] YANG Y, LI M X, DUAN Y B, LI T, SHI Y Y, ZHAO D L, ZHOU Z H, XIN W J, WU J, PAN X Y, LI Y J, ZHU Y Y, ZHOU M G. A new point mutation in2-tubulin confers resistance to carbendazim in., 2018, 145: 15-21.

[39] 尚巖. 桃、櫻桃灰霉病菌對(duì)七種殺菌劑的抗藥性研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

SHANG Y. Study on resistance offrom peach and cherry to seven fungicides[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[40] 賈嬌, 蘇前富, 孟玲敏, 張偉, 李紅, 劉婉麗, 晉齊鳴. 禾谷鐮孢菌對(duì)咯菌腈的抗藥性誘導(dǎo)及對(duì)不同藥劑的交互抗性//中國植物病理學(xué)會(huì)會(huì)議論文集, 2015: 553.

JIA J, SU Q F, MENG L M , ZHANG W, LI H, LIU W L, JIN Q M. The resistance ofto fludioxonil and the interaction resistance to different medicaments//, 2015: 553. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 岳梅）

Resistance Detection and Mechanism of Strawberryto Fludioxonil in Sichuan Province

GONG ChangWei, QIN YiMan, QU JinSong, WANG XueGui

(College of agronomy/Biorational Pesticide Research Laboratory, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130)

【Objective】Grey mold is an important disease in strawberry production, which seriously affects the yield and quality of strawberry.The objective of this study is to clarify the resistance frequency and resistance mechanism ofin different strawberry-growing areas in Sichuan Province, and to provide theoretical basis for the fungicide control of strawberry grey mold.【Method】The disease samples were collected from Chengdu, Deyang, Meishan, Leshan and Yaan in Sichuan Province from 2016 to 2017, and 188 strains ofwere isolated and purified. The sensitivity of 188 strains ofwas classified with the distinguish measurement method. The toxicity and osmotic pressure sensitivity of fludioxonil to some representative strains were assayed using the method of mycelial growth-inhibition capacity. The glycerol content of the resistant and sensitive strains treated with fludioxonil was determined by the method of glycerol-copper colorimetric assay. The sequences of type III histidine kinase gene(BC1G_00374) in the resistant- and sensitive-fludioxonil strains were piecewise amplified and sequenced. The effects of mutations on the structure of BOS1 were predicted and evaluated by Swissmodle and I-TASSER, respectively.【Result】Of 188 strains, 8 strains showed high resistance, 9 strains showed medium resistance, 43 strains showed low resistance and the rest were sensitive. The EC50of representative strains ranged from 0.03 to 0.62 μg·mL-1, and the resistance multiple of the representative strains ranged from 2.2 to 45.9. The concentrations of 1.25-10 g·L-1and 1.25-20 g·L-1NaCl could stimulate the hypha growth of the sensitive- and resistant-fludioxonil strains, respectively, whereas the concentration of ＞40 g·L-1inhibited the hypha growth, especially in the resistant strains, and the higher the resistant level, the stronger the inhibition rate. The glycerol content of representative strains ranged from 0.0025 to 0.0148 μg·mL-1under normal conditions, and there was no significant correlation between glycerol content and fludioxonil resistance of the strain, but the glycerol content of the resistant and sensitive strains increased after the treatment of fludioxonil (0.1 μg·mL-1). The increase of glycerol content in resistant strains was significantly lower than that in sensitive strains. The low resistance strains YAHY-13, CDCZ-2 and medium resistance strain CDCZ-42 mutated in the TAR and HAMP regions, meanwhile the medium resistance strain CDCZ-20 and high resistance strains MYFC-10 and CDCZ-43 mutated in TAR and REC regions, whereas the mutation site of TAR region in CDCZ-20 was I365N, and which of MYFC-10 and CDCZ-43 was I365S. Different mutation positions showed different effects on the region structure of BOS1, in which the F127S, I365N, I365S, V1136I, A1259T were all in the irregular curl of BOS1 structure, but the I365N and I365S in TAR region made the overall deviation of the region structure irregular curl. 【Conclusion】In some areas of Sichuan Province,has developed resistance to fludioxonil. Compared with the sensitive strains, the tolerance ability of field resistant strains to osmotic pressure increased, but when the concentrations exceeded the tolerance range, they were highly sensitive to osmotic stress and the increase of glycerol content in the field resistant strains under the fludioxonil stress was significantly lower than that of the sensitive strains. The mutation position and mode of histidine kinase BOS1 are closely related to the resistance level ofto fludioxonil.

; fludioxonil; resistance;osmotic pressure; glycerol content;

2018-06-04；

2018-07-27

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303025）

貢常委，Tel：028-86290977；E-mail：youguqiu@163.com。

王學(xué)貴，Tel：028-86290977；E-mail：wangxuegui@sicau.edu.cn