張欽寧 燕華玲 任立汆 加楊娥 王睿智

柴達(dá)木黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)，系茄科枸杞屬，生物學(xué)價(jià)值高，可食用可入藥。柴達(dá)木黑果枸杞水提物中含有色素、枸杞多糖、維生素、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)黑果枸杞果實(shí)中的色素具有清除自由基，抗氧化，延緩衰老的作用[1]，但具體機(jī)制不甚清楚。目前對(duì)柴達(dá)木黑果枸杞的研究大多集中在抗氧化、降血糖、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫等方面，在抗衰老方面研究較少。對(duì)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞中p16、p53蛋白表達(dá)的影響及柴達(dá)木黑果枸杞水提物減輕UVB輻射損傷HaCaT細(xì)胞的機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)研究黑果枸杞水提取對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡及p16、p53蛋白表達(dá)的影響，探討其可能減輕UVB輻射損傷的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 柴達(dá)木黑果枸杞(青海諾藍(lán)杞生物科技開(kāi)發(fā)有限公司)；HaCaT細(xì)胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；TL20W/12 紫外線 UVB 燈管(飛利浦) ；臺(tái)灣路昌 UVB 輻照度監(jiān)示器；X-Mark 型 BIO-RAD 酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)；凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD Pharmingen公司)；Anti-p16 ARC antibody(ab51243)、Anti-p53 antibody(ab194736)、Anti-β- actin antibody(ab8227)(英國(guó)Abcam公司)，Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(proteintech公司)，RIPA裂解液、BCA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 研究方法

1.2.1 HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng) 以含10%胎牛血清的 DMEM 為培養(yǎng)基(內(nèi)含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素) ，接種于培養(yǎng)瓶后，置于37℃ 5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及操作方法 隨機(jī)分為3組，“對(duì)照組”；“UVB組”；“UVB+黑果枸杞水提物”。黑果枸杞水提取物粉末以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基為溶劑，配制成2 mg/mL濃度(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇)，并用0. 22 μm 孔徑過(guò)濾器過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用，輻射前6 h加入?？瞻捉M用錫箔紙覆蓋，3組同時(shí)置于UVB燈管的正下方，距離20 cm，強(qiáng)度為30 mJ/cm2。輻射后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)；輻射后24 h提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。單獨(dú)重復(fù)5次。

1.2.3 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖 96孔板內(nèi)HaCaT細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行分組處理后，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。然后每孔加入MTS溶液20 μL，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h。終止培養(yǎng)后，酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定并記錄各孔吸光度值。每組單獨(dú)重復(fù)6次。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，提前預(yù)冷的PBS洗2次，將細(xì)胞重懸于100 μL Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入400 μL Binding Buffer，1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)p16和p53蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2次，細(xì)胞中加入含PMSF的蛋白裂解液(蛋白酶抑制劑∶蛋白裂解液為1∶100)，輕輕吹打，置于冰上裂解30 min，直至液體清亮，4℃、12000 r/min離心取上清，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，放入沸水中煮10 min，使蛋白變性。制備12% SDS-PAGE凝膠，4℃過(guò)夜。蛋白定量后，每槽加入20 μg蛋白，各組蛋白離心后上樣，電泳，80V恒壓電泳2 h，恒壓100V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入一抗4℃搖床孵育雜交過(guò)夜(p16濃度為1∶1000；p53濃度為1∶2000)，復(fù)溫1 h，TBST震蕩洗膜6次，6 min/次，辣根過(guò)氧化物酶山羊抗兔IgG二抗，室溫?fù)u床下孵育2 h，TBST震蕩洗膜，加入ECL發(fā)光液，暗視下顯影，熒光強(qiáng)度代表蛋白樣品的相對(duì)含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖檢測(cè) UVB照射組A值較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黑果枸杞水提物組A值較UVB組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。提示黑果枸杞水提物可減輕UVB輻射HaCaT細(xì)胞引起的細(xì)胞增殖率下降，但不能完全抑制UVB的損傷。

表1 MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果見(jiàn)表2及圖1， UVB輻射后的細(xì)胞凋亡率明顯增加，黑果枸杞水提物組較UVB組細(xì)胞凋亡率明顯下降，說(shuō)明黑果枸杞水提物能夠降低UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的凋亡。

表2 黑果枸杞水提物對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

注：#與對(duì)照組比較，P<0.05；*與UVB組比較，P<0.05

圖1 各組HaCaT細(xì)胞凋亡率比較

2.3 Western blot檢測(cè) Western blot檢測(cè)p16和p53蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2，UVB組與對(duì)照組比較p16和p53蛋白表達(dá)明顯升高，黑果枸杞水提物2 mg/mL組與UVB組比較，p16和p53蛋白表達(dá)明顯下降，說(shuō)明黑果枸杞水提物可能通過(guò)降低p16和p53蛋白表達(dá)來(lái)降低UVB輻射HaCaT細(xì)胞的光損傷(圖3、4)。

圖2 黑果枸杞水提物對(duì)HaCaT細(xì)胞p16和p53蛋白表達(dá)水平的影響

注：#與對(duì)照組比較，P<0.05；*與UVB組比較，P<0.05

注：#與對(duì)照組比較，P<0.05；*與UVB組比較，P<0.05

3 討論

皮膚光老化(skin photoaging)是指皮膚長(zhǎng)期在紫外線(ultraviolet,UV)的輻射下導(dǎo)致皮膚發(fā)生形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)的改變。長(zhǎng)期居住在高原地區(qū)，光老化現(xiàn)象嚴(yán)重，在光暴露部位，如面、頸、手背、前臂以及上胸部出現(xiàn)皮膚彈性喪失、皺紋增多粗深、皮膚粗糙、色素異常、毛細(xì)血管擴(kuò)張、皮膚無(wú)光澤或呈灰黃色，甚至導(dǎo)致皮膚癌癥。目前研究證實(shí)光老化主要是由于UV輻射改變DNA、細(xì)胞抗氧化平衡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、免疫學(xué)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。UV誘導(dǎo)的光老化DNA的改變包括紫外線輻射誘導(dǎo)嘧啶二聚體和腫瘤抑制基因p53的損失[2]?，F(xiàn)研究皮膚光老化涉及MAPK、TGFβ1及NF-κB等多條信號(hào)通路[3]。

UVB是引起皮膚光老化主要的因素，主要的靶細(xì)胞是皮膚第一道防線的角質(zhì)形成細(xì)胞。本研究證實(shí)黑果枸杞水提物可減輕UVB輻射HaCaT細(xì)胞引起的細(xì)胞增殖率下降，并明顯降低UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的凋亡率。減少UVB的照射損傷是預(yù)防光老化的重點(diǎn)。本研究結(jié)果提示在單次UVB照射中，黑果枸杞水提物雖不能完全抑制UVB的損傷，但可減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的損傷。單次UVB的照射僅引起光損傷，長(zhǎng)期的UV照射則可引起光老化，黑果枸杞水提物這種減少光損傷的作用，推測(cè)其可減少光老化。現(xiàn)研究證實(shí)黑果枸杞中多種成分，如原花青素、酚類、黃酮類、多糖等多種成分具有抗氧化作用[4-9]，其中黃酮類物質(zhì)較難溶于水，其余物質(zhì)均易溶于水。但現(xiàn)階段研究集中在這些成分自由基清除能力及炎性物質(zhì)的研究上，未見(jiàn)對(duì)于細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白的研究。

本研究證實(shí)UVB照射后HaCaT細(xì)胞p16、p53蛋白表達(dá)升高。p16基因位于9PH區(qū),其作用機(jī)制主要與其編碼蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖有關(guān)，其基因產(chǎn)物p16蛋白可與cycilnD競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞周期素依賴性激酶4(CDK4)，直接作用于cycilnD/Rb/CDK4的反饋回路而阻止細(xì)胞增殖。與閔瑋等[10]UVB照射HaCaT細(xì)胞后p16蛋白水平有所增高相一致。p53是重要的腫瘤抑制基因，其表達(dá)的p53蛋白可以上調(diào)Bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。

黑果枸杞水提物減少UVB輻射引起HaCaT細(xì)胞凋亡率增加，p16和p53蛋白表達(dá)增加、延緩細(xì)胞衰老。研究證實(shí)芍藥苷可通過(guò)抑制p53在人類角質(zhì)細(xì)胞的激活從而抑制UVB誘導(dǎo)的皮膚損傷[11]。p53的過(guò)度表達(dá)還使其成為一種有實(shí)用價(jià)值的標(biāo)志物，用于鑒別顳骨鱗狀細(xì)胞癌高危個(gè)體[12]。p16是細(xì)胞周期的調(diào)控者，它與許多腫瘤的形成和發(fā)展關(guān)系密切，其突變、缺失、甲基化廣泛存在于各種腫瘤中，很可能是一種在腫瘤發(fā)生中起重要作用的腫瘤抑制基因[13]。黑果枸杞水提物可抑制UVB照射后HaCaT細(xì)胞p16、p53蛋白表達(dá)，黑果枸杞水提物可能具有抑制光相關(guān)腫瘤的作用，需研究證實(shí)。

光老化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，導(dǎo)致DNA損傷，不僅包括衰老相關(guān)蛋白p16、p53的異常表達(dá)，還涉及其他蛋白的異常。李文靜等發(fā)現(xiàn)5種蛋白參與光老化，分別是熱休克蛋白B1(Heat shock protein B1,HSPB1)、膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)、角蛋白80(Keratin，type II cytoskeletal80，K2C80)、絲裂原激活的蛋白激酶3(Mitogen-activated protein kinase3，MK03)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A2(Glutathione S-transferase A2，GSTA2)，其中HSPB1、ANXA2、K2C80和MK03在老年人曝光部位的表皮中高表達(dá)而GSTA2在非曝光部位表皮中高表達(dá)[14]。

有針對(duì)性的尋找安全、高效的防光損傷的天然產(chǎn)物有十分重要的意義。大量天然植物防光研究的結(jié)果肯定了中藥及提取物對(duì)抗光損傷的作用，天然植物及提取物對(duì)抗光損傷的作用與其所含的多糖、維生素、酚類化合物(黃酮、酚、酚酸、原花色素、單寧等)有很大關(guān)系[15，16]。而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黑果枸杞不僅含有多糖，其含有獨(dú)特的原花青素、花色苷、總多酚等營(yíng)養(yǎng)成分，抗氧化作用強(qiáng)[17]。除此之外，黑果枸杞中的類胡蘿卜素、核黃素、抗壞血酸、硫氨素和煙酸這些物質(zhì)可能也參與了抗氧化反應(yīng)[18]。研究表明，每克黑果枸杞中總抗氧化性的維生素C當(dāng)量為109.73 mg[19]。維生素C作為抗氧化劑，可修復(fù)皮膚皺紋、改善皮膚粗糙等[20]。研究報(bào)道，維生素C還有效地拮抗紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21]?，F(xiàn)階段黑果枸杞在食品、藥品方面的利用較欠缺，相比而言，維生素C價(jià)格便宜，易于購(gòu)買使用。但柴達(dá)木黑果枸杞不僅可防光損傷、具有抗氧化作用，還可降血糖、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫，開(kāi)發(fā)后其生態(tài)價(jià)值、藥用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值相當(dāng)可觀[22]。

本研究證實(shí)黑果枸杞水提物能顯著降低p16、p53蛋白表達(dá)，從分子水平去探討抗衰老的機(jī)制，為中藥防治衰老提供了一定的科學(xué)理論依據(jù)，為開(kāi)發(fā)抗衰老中藥、發(fā)揚(yáng)祖國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)提供了新的思路。為尋找與皮膚光老化相關(guān)的特異性生物效應(yīng)指標(biāo)提供了線索，為指導(dǎo)皮膚美容奠定了基礎(chǔ)。