古麗妮嗄爾·菲達(dá)， 賈 琳， 賈文霄

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第二附屬醫(yī)院影像中心， 烏魯木齊 830063； 2第一附屬醫(yī)院影像中心， 烏魯木齊 830054)

前列腺癌是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)隨著我國(guó)人口的老齡化，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是將人的單核細(xì)胞從外周血中分離出來(lái)，并用白細(xì)胞介素IL-2、干擾素γ、CD3單抗等因子進(jìn)行誘導(dǎo)后培養(yǎng)擴(kuò)增獲得的免疫活性細(xì)胞,能夠選擇性高效殺傷腫瘤細(xì)胞，具有很強(qiáng)的體外增殖能力，能夠直接或間接的作用于腫瘤細(xì)胞，對(duì)患者副作用小，安全高效[2]。磁共振波譜成像技術(shù)(Magnetic Resonance Spectroscopy, MRS)是一種磁共振分子成像的方法，能夠?qū)C(jī)體內(nèi)特定的原子核以及化合物進(jìn)行量化分析，無(wú)創(chuàng)傷提供組織代謝水平的變化信息，已被廣泛應(yīng)用于臨床[3]。MRS技術(shù)在前列腺癌早期診斷中的臨床應(yīng)用日漸成熟，能夠?qū)η傲邢俳M織中的枸櫞酸鹽(Citrate, Cit)、肌酸(Creatine, Cre)和膽堿(Choline, Cho)的濃度進(jìn)行定量檢測(cè)，通過(guò)(肌酸+膽堿)/枸櫞酸鹽即CC/C值來(lái)診斷及鑒別前列腺疾病，MRS可以直觀地顯示這3種代謝物的峰值變化，為前列腺癌的臨床診斷及分級(jí)提供影像學(xué)依據(jù)[4]。目前對(duì)于CIK細(xì)胞免疫治療對(duì)前列腺癌的療效研究?jī)H限于臨床中的評(píng)價(jià)方法，影像學(xué)研究報(bào)道甚少。本研究采用MRS成像技術(shù)獲得定量參數(shù)的方法，研究前列腺癌免疫治療后腫瘤的抑制狀態(tài)，為CIK細(xì)胞免疫治療提供影像學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB/C-nu裸鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量(19.0±1.0)g。

1.2細(xì)胞懸液的配制人型前列腺癌PC-3細(xì)胞株(購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù))，按照無(wú)菌操作方法對(duì)PC-3細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及擴(kuò)增后胰酶消化配制成細(xì)胞懸液。培養(yǎng)和擴(kuò)增使用的培養(yǎng)基為F-12培養(yǎng)液,10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗,培養(yǎng)箱條件5% CO2、37℃恒溫。細(xì)胞加入胰蛋白酶進(jìn)行消化離心后,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞，并用PBS液配制成1×106個(gè)/mL細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液。

1.3CIK細(xì)胞的制備取健康人外周血用淋巴分離液將淋巴細(xì)胞分離并接種于培養(yǎng)瓶中，完全培養(yǎng)液中加入IFN-γ，置于5% CO2、恒溫37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入500 U/mL IL-2、100 U/mL IL-1α、和500 Ung/mL CD3單抗，培養(yǎng)液每3 d更換1次，并加入500 U/mL IL-2，培養(yǎng)2 w后獲得CIK細(xì)胞，收集CIK細(xì)胞后對(duì)其進(jìn)行流式檢測(cè)鑒定其表面標(biāo)志物。

1.4前列腺癌裸鼠移植瘤模型的分組及建立取“1.2”項(xiàng)下的PC-3細(xì)胞懸液以每只裸鼠0.2 mL的用量在裸鼠右后肢背部皮下進(jìn)行接種。將48只裸鼠隨機(jī)分為CIK免疫治療組和空白對(duì)照組，每組24只，空白對(duì)照組裸鼠連續(xù)3 w腹腔注射等量生理鹽水，免疫治療組裸鼠連續(xù)3 w在接種部位注射0.2 mL 1×1010/L的CIK細(xì)胞懸液。2組裸鼠均于治療后第7、14、21 d進(jìn)行磁共振成像掃描，掃描后將2組分別處死8只裸鼠測(cè)量腫瘤大小、體積和質(zhì)量，取腫瘤組織進(jìn)行病理及腫瘤細(xì)胞凋亡檢查。

1.5MRS掃描方法采用PHILIPS 1.5T超導(dǎo)型MRI掃描儀動(dòng)物專用25 mm顯微信號(hào)采集線圈對(duì)實(shí)驗(yàn)裸鼠進(jìn)行掃描，掃描前將載瘤裸鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。常規(guī)MRI進(jìn)行冠狀位掃描，掃描序列為TSE-T1WI及TSE-T2WI，掃描層厚2.5 mm，間距0 mm，層數(shù)10層。MRS掃描采用PRESS序列，選擇冠狀面進(jìn)行掃描，MRS掃描參數(shù)：TR=1 700 ms，TE=135 ms，層厚2 mm(可根據(jù)腫瘤大小進(jìn)行調(diào)整)，無(wú)間隔掃描，層數(shù)50層，F(xiàn)OV=60 mm，采集次數(shù)(NSA)8次，矩陣128×128，掃描間隔為0。

1.6MRS圖像后處理將MRS原始圖像使用PHILIPS工作站的專用軟件進(jìn)行后處理，經(jīng)3名研究人員重復(fù)測(cè)量ROI及MRS參數(shù)并取其平均值，選取感興趣區(qū)時(shí)盡量選取同一層面同一位置并且避開(kāi)腫瘤的壞死及出血區(qū)域。由此得到前列腺癌移植瘤的MRS譜線圖，軟件自動(dòng)計(jì)算得到膽堿、肌酸、枸櫞酸鹽等主要代謝物的峰高、波峰下面積以及代謝物的比值。

1.7病理學(xué)檢查及分析方法在免疫治療前，對(duì)收集的CIK細(xì)胞進(jìn)行表型檢測(cè)(流式細(xì)胞術(shù))。治療后第7、14、 21 d的MRS掃描結(jié)束后，每組分別處死8只裸鼠，將剝離出的腫瘤組織浸泡在10%福爾馬林溶液中，測(cè)量瘤體的體積和重量并進(jìn)行記錄，隨后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片并進(jìn)行常規(guī)HE染色及TUNNEL腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)，得到前列腺癌細(xì)胞的凋亡范圍。

2 結(jié)果

2.1CIK細(xì)胞表型鑒定結(jié)果培養(yǎng)14 d后對(duì)CIK細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，分析細(xì)胞表型發(fā)現(xiàn)，CIK細(xì)胞中雙陽(yáng)性CD3+CD56+的比例隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加,培養(yǎng)14 d后CD3+CD56+的比例達(dá)到62.07%，CD4+CD8+的比例達(dá)到20.79%。發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)和增殖能夠獲得穩(wěn)定表達(dá)的多種細(xì)胞因子。

2.22組裸鼠MRS各參數(shù)測(cè)定結(jié)果在進(jìn)行治療前，空白對(duì)照組及CIK免疫治療組前列腺癌裸鼠皮下移植瘤的(Cho+Cre)/Cit比值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后，與空白對(duì)照組比較，CIK免疫治療組的(Cho+Cre)/Cit比值持續(xù)降低，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。對(duì)2組裸鼠進(jìn)行治療前和治療第7、14、21d的MRS圖像分析發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，CIK免疫治療組的Cit峰逐漸升高，Cho峰逐漸減低，Cre峰變化無(wú)明顯差異。而對(duì)照組Cit峰逐漸降低，Cho峰逐漸升高，見(jiàn)圖1、2。

表1 兩組裸鼠皮下移植瘤MRS不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)(Cho+Cre)/Cit比值測(cè)量結(jié)果

圖1 CIK免疫治療組裸鼠治療前的MRS圖

圖2 CIK免疫治療組裸鼠治療后MRS圖

2.3MRS各參數(shù)與病理腫瘤凋亡結(jié)果的相關(guān)性分析CIK免疫治療組裸鼠在治療后2 w內(nèi)瘤體的體積均有縮小并且瘤體與對(duì)照組相比較局限。裸鼠掃描結(jié)束后取出腫瘤組織做HE染色,發(fā)現(xiàn)CIK免疫治療組的腫瘤細(xì)胞與對(duì)照組相比凋亡細(xì)胞較多，治療時(shí)間越長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)壞死部分越多，細(xì)胞崩解，并且有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIK免疫治療組的腫瘤細(xì)胞凋亡較對(duì)照組增加。將MRS獲得的(Cho+Cre)/Cit定量參數(shù)與腫瘤凋亡檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，(Cho+Cre)/Cit比值與腫瘤凋亡檢測(cè)結(jié)果之間均有良好相關(guān)性。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(Cho+Cre)/Cit比值與腫瘤細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 裸鼠皮下移植瘤治療后(Cho+Cre)/Cit比值與TUNEL結(jié)果的相關(guān)性分析

3 討論

MRS技術(shù)能夠獲得組織內(nèi)部分生物物質(zhì)的成分和含量信息，并進(jìn)行量化分析，從分子水平反映組織的病理生理過(guò)程[5]。將MRS的代謝信息與常規(guī)MRI得到的圖像相結(jié)合，能夠大大提高對(duì)腫瘤大小、位置、腫瘤性質(zhì)的判斷，方便臨床醫(yī)師及時(shí)制定治療方案，實(shí)時(shí)對(duì)腫瘤變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)研究者也逐漸開(kāi)始對(duì)CIK細(xì)胞及相關(guān)免疫療法進(jìn)行各種臨床研究，前列腺的MRS檢查中最有意義的3種代謝物為枸椽酸鹽(Citrate，Cit)、膽堿(Choline，Cho)和肌酸(Creatine，Cre)[6-9]。CIK細(xì)胞不僅具有T淋巴細(xì)胞的抗瘤活性，還兼具自然殺傷細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤的優(yōu)勢(shì)[10]，能夠?qū)δ[瘤進(jìn)行選擇性殺傷，并且抗瘤譜廣泛，不良反應(yīng)少，其活性不被免疫抑制劑影響。裸鼠的人腫瘤移植瘤模型能夠較好地體現(xiàn)人類腫瘤的特性，能夠?yàn)樘骄咳梭w腫瘤的特性、觀察各種影像表現(xiàn)以及評(píng)價(jià)臨床治療后的療效等提供一個(gè)理想的平臺(tái)[11,12]。CHEN等[13]對(duì)前列腺癌移植瘤進(jìn)行MRS掃描后發(fā)現(xiàn)磁共振波譜得到的參數(shù)能夠有效地鑒別惡性腫瘤組織和正常組織。本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)MRS圖像中Cit和Cho峰的變化直觀地觀察到CIK免疫治療后腫瘤組織代謝水平的改變，并且通過(guò)(Cho+Cre)/Cit的比值能夠?qū)⑦@種代謝改變進(jìn)行量化。在對(duì)2組裸鼠在治療前和治療后的4個(gè)時(shí)期進(jìn)行MRS掃描后發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，CIK免疫治療組的(Cho+Cre)/Cit的比值降低，說(shuō)明MRS得到與代謝相關(guān)的參數(shù)能夠直觀地反映腫瘤CIK免疫治療前后的代謝改變。另外還發(fā)現(xiàn)MRS檢測(cè)到腫瘤代謝的改變?cè)缬谀[瘤形態(tài)學(xué)的改變，這也說(shuō)明了MRS能夠在早期就檢測(cè)到腫瘤的代謝改變，對(duì)于早期評(píng)價(jià)CIK的療效具有良好的效果。雖然這一結(jié)果還需要更多的重復(fù)性研究來(lái)證明，但是這也肯定了MRS獲得的(Cho+Cre)/Cit比值在早期評(píng)價(jià)CIK療效中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究中前列腺癌裸鼠皮下移植瘤在治療后7、14、21 d分別處死8只裸鼠進(jìn)行HE染色及TUNEL檢測(cè)，對(duì)照組裸鼠沒(méi)有進(jìn)行干預(yù)治療，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，CIK免疫治療組裸鼠進(jìn)行治療后，腫瘤細(xì)胞凋亡速度增加，證明CIK細(xì)胞具有抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)，加速腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。研究結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果與(Cho+Cre)/Cit比值呈負(fù)相關(guān)，認(rèn)為這可能是前列腺癌組織分泌Cit的腺管被破壞，導(dǎo)致Cit含量減少，在進(jìn)行CIK免疫治療后，由于前列腺癌細(xì)胞的凋亡以及免疫反應(yīng)的增強(qiáng)，Cit的含量與治療前相比增多。CIK免疫治療相對(duì)其他治療價(jià)格昂貴，能夠早期評(píng)價(jià)療效對(duì)患者后期的治療方案的確定具有很大的幫助。MRS成像技術(shù)作為目前唯一能夠量化腫瘤組織代謝水平的影像學(xué)技術(shù)[14,15]，對(duì)于免疫治療的療效評(píng)價(jià)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)本研究也有一定的局限性，研究中影像學(xué)技術(shù)所選取的癌灶區(qū)域與病理選取的區(qū)域很難保持完全一致，存在一定偏差。本研究探討了CIK免疫治療對(duì)前列腺癌裸鼠移植瘤的治療效果，結(jié)果表明磁共振波譜成像技術(shù)獲得的定量參數(shù)能夠很好地反映CIK免疫治療后腫瘤代謝水平變化的情況，對(duì)于CIK免疫治療療效的評(píng)價(jià)是有價(jià)值的評(píng)價(jià)指標(biāo)，在評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)細(xì)胞代謝情況和評(píng)估腫瘤的治療療效方面具有很大的研究?jī)r(jià)值。