黃 瑋，姚強(qiáng)文，包明燕

（1．四川省資陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 資陽 641300； 2．四川金輝藥業(yè)有限公司，四川 資陽641300； 3．四川省資陽市第一人民醫(yī)院，四川 資陽 641300）

五子補(bǔ)腎強(qiáng)身丸為簡(jiǎn)陽市中醫(yī)醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方劑，為由枸杞子、菟絲子、淫羊藿[1]、制何首烏、當(dāng)歸等11味中藥制成的大蜜丸，主治補(bǔ)益肝腎、養(yǎng)血生精，用于腎虛精少不育，陽痿早泄、性功能低下、腰脊酸痛、神疲乏力等腎虛體弱癥[2]。參考文獻(xiàn)[3-10]，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定五子補(bǔ)腎強(qiáng)身丸中淫羊藿苷的含量，快速準(zhǔn)確?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（安捷倫公司，包括VWD檢測(cè)器和LC solution工作站）；XS205型電子分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DV型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)為110737-201516，含量為94．2%，中國食品藥品檢定研究院）；五子補(bǔ)腎強(qiáng)身丸（大蜜丸，每丸重 9 g，醫(yī)院自制制劑，批號(hào)分別為150623，151014，160405，160801，161120，170309）；乙醇(分析純，成都科龍化學(xué)試劑廠）；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司）；試驗(yàn)用水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為M18011302）；滅菌注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax EclipsePlusC18柱(250 mm×4．6mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈(A）-水(B），梯度洗脫（0～8 min時(shí) 10%A，9～35 min時(shí) 10%A→35%A，35～40 min時(shí)10%A）；流速：1．0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。在此色譜條件下，理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000，相鄰峰之間分離度均大于1．5。色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，即得淫羊藿苷對(duì)照品質(zhì)量濃度為0．103 4 g/L的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液2．0 mL，置25 mL容量瓶中，加稀乙醇配制成約為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即得對(duì)照品溶液。剪碎本品，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為300 W，頻率為 60 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0．45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例和樣品制備工藝制成不含淫羊藿的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察[11-15]

專屬性試驗(yàn)：取2．2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各5 μL，進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖中，在與對(duì)照品溶液淫羊藿苷色譜峰處，陰性對(duì)照品溶液無此峰出現(xiàn)，表明其對(duì)樣品測(cè)定無干擾。

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品貯備液0．25，0．50，1．00，2．00，3．00，5．00 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加稀乙醇定容至刻度，搖勻，即得1～5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積(Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得淫羊藿苷回歸方程Y=1．422X+2．343，r=0．999 6(n=6），進(jìn)樣質(zhì)量濃度線性范圍為 2．104 ～407．300 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2．2項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD為0．56%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為160405）適量，共6份，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果的RSD為0．92%(n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為160405）適量，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為0．78%(n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為160405，含量為0．103 mg/g）6 份，每份約 2 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品貯備液80%，100%，120%，各2份，分別按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

分別取6批樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果 批 號(hào) 為 150623，151014，160405，160801，161120，170309樣品中淫羊藿苷含量分別為每丸0．973，1．022，0．924，0．986，1．055，0．947 mg。

3 討論

檢測(cè)成分選擇：該復(fù)方制劑的主要藥味有枸杞子、菟絲子、淫羊藿、制何首烏、當(dāng)歸等，其中淫羊藿為方中主藥，投藥量較大，其主要功效為補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，用于治療陽痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣，更年期高血壓。與淫羊藿補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨功效主治相關(guān)的藥理作用為增強(qiáng)性腺功能，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)骨生長(zhǎng)，延緩衰老等，其還具有強(qiáng)心、降血壓、抗心律失常、增加腦血流量、抑菌、抗病毒、抗炎、調(diào)血脂、抗腫瘤等多種作用，具有較高的藥用和保健價(jià)值。

色譜條件選擇：本研究中采用梯度洗脫法分離的成分，40 min內(nèi)完成分離，淫羊藿苷分離效果良好，符合含量測(cè)定要求。本研究中通過二極管陣列檢測(cè)器考察所測(cè)物質(zhì)紫外吸收度，在270 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，故選擇270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相比較了乙腈-水和乙腈-0．05%磷酸系統(tǒng)，乙腈-水梯度洗脫各色譜峰均實(shí)現(xiàn)基線分離，能達(dá)到定量要求。

稀釋溶劑選擇：標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的稀釋溶劑曾選擇水、稀乙醇、乙醇、50%甲醇和甲醇分別檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)用稀乙醇檢測(cè)時(shí)樣品雜質(zhì)峰較少，且淫羊藿苷出峰時(shí)間無干擾。

提取條件優(yōu)化：本研究中對(duì)不同提取方式（加熱回流和超聲）、提取溶劑（稀乙醇、70%乙醇溶液和乙醇）及提取時(shí)間（30，45，60 min）和取樣量（0．5，1．0，2．0 g）進(jìn)行考察，最終確定，稱取樣品2．0 g，加稀乙醇50 mL，超聲提取30 min為最佳提取條件。

耐用性考察：本研究中分別考察了日本島津LC-20AT型高效液相色譜儀、美國安捷倫1260型高效液相色譜儀和3種同類填料不同品牌的色譜柱進(jìn)行淫羊藿苷的可重復(fù)性測(cè)定，并驗(yàn)證方法的可重復(fù)性。結(jié)果表明，該方法適用性及耐用性良好。

該醫(yī)院制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《四川省食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn) SZBZ20081208-11(Z）》[2]，僅有顯微鑒別、當(dāng)歸藥材的薄層色譜鑒別，未對(duì)含量進(jìn)行控制，不能全面反映該制劑的質(zhì)量水平，且國內(nèi)尚未見對(duì)五子補(bǔ)腎強(qiáng)身丸中淫羊藿苷有效成分含量進(jìn)行控制的報(bào)道。本研究中建立的方法可測(cè)定五子補(bǔ)腎強(qiáng)身丸淫羊藿苷成分的含量，方法簡(jiǎn)便、快速，可用于五子補(bǔ)腎強(qiáng)身丸的含量測(cè)定，為綜合評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供準(zhǔn)確、快速的定量分析方法，也為五子補(bǔ)腎強(qiáng)身丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。在進(jìn)行化學(xué)成分含量測(cè)定時(shí)，有2個(gè)不明物質(zhì)的峰較高，從樣品測(cè)定結(jié)果來看，這3種成分的含量均大于每丸1．0 mg，有待進(jìn)一步深入研究。