繆 紅 ，徐丹洋 ，蘇 健 △

（1．江蘇省南通市婦幼保健院，江蘇 南通 226010； 2．江蘇省南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 南通 226006）

大黃瀉火散現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十九冊(cè)）》[1]，組方為大黃、薄荷、炙甘草、芒硝、連翹、黃芩、炒梔子仁，粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻，具有清熱瀉火的功效，臨床用于胸膈煩熱、口渴便秘。大黃瀉火散原標(biāo)準(zhǔn)只有性狀及大黃中蒽醌類及芒硝的鑒別項(xiàng)，缺少有效的質(zhì)控項(xiàng)目。由于大黃和連翹是方中主藥，參考《中國(guó)藥典》及文獻(xiàn)[2]，選擇大黃中大黃素、大黃酚及連翹中的連翹苷作為質(zhì)控指標(biāo)。為了提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究中建立并增加了大黃、薄荷、炙甘草、連翹、黃芩、炒梔子仁的顯微鑒別，炙甘草和黃芩的薄層色譜（TLC）鑒別，以及大黃中大黃素、大黃酚及連翹中的連翹苷的含量測(cè)定方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀（戴安儀器公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水機(jī)（Millipore公司）；CPA225D 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BX51-DP72型顯微成像系統(tǒng)（奧林帕斯公司）；TUBE-mill 100 C S025型粉碎機(jī)（IKA公司）；藥典篩（湖南省常德粒度分析儀器廠）。

1.2 試藥

對(duì)照品大黃素（批號(hào)為110756-201512）、大黃酚（批號(hào)為 110796-201621）、連翹苷（批號(hào)為 110821-201615）、黃芩苷（批號(hào)為 110715-201619）、黃芩素（批號(hào)為 111595-201607）、甘草酸銨（批號(hào)為 110731-201619），對(duì)照藥材黃芩（批號(hào)為120955-201309）和甘草（批號(hào)為120904-201519），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G預(yù)制板(默克公司）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純；本試驗(yàn)所用樣品均為飲片粉碎后混勻自制；飲片分別購(gòu)自南通三越飲片公司及同仁堂，經(jīng)南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心葛建華主任中藥師鑒定為正品。自制樣品6批次，1～3號(hào)樣品的飲片均來(lái)源于南通三越飲片公司，4～6號(hào)樣品的飲片來(lái)源于同仁堂公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別[3]

取1～6號(hào)樣品細(xì)粉，分別以水合氯醛透化制片，置顯微鏡下觀察?？梢?jiàn)，草酸鈣簇晶較多，類圓形，直徑20～160 μm，棱角大多短鈍；偏光顯微鏡下，結(jié)晶亮黃白色間多彩狀（大黃）。非腺毛1～8個(gè)細(xì)胞，多彎曲，壁厚，具疣狀突起（薄荷）；顯微多成束，周圍細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維（炙甘草）。果皮表皮細(xì)胞表面觀呈類圓形或類方形，內(nèi)充滿黃棕色物質(zhì)（連翹）。韌皮纖維單個(gè)散在或成束，梭形，壁厚，溝孔細(xì)；偏光顯微鏡下，呈亮黃白色（黃芩）。種皮石細(xì)胞黃色或淡棕色，類長(zhǎng)方形、梭形、長(zhǎng)橢圓形或不規(guī)則形，壁厚，紋孔大；偏光顯微鏡下，石細(xì)胞呈亮黃色（炒梔子仁）。6個(gè)組分的顯微特征明顯，方法重復(fù)性良好。詳見(jiàn)圖1。

圖1 顯微鑒別圖

2.2 TLC鑒別

黃芩：取樣品細(xì)粉 5g，加乙酸乙酯 -甲醇（3∶1）30mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩對(duì)照藥材0．5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺黃芩的陰性樣品5 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液。取黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品分別制成每1 mL約含1 mg的對(duì)照品溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502中薄層色譜法[4]，分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各5 μL及對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一含1%草酸的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（9∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。1～6號(hào)樣品分別做相應(yīng)的陰性樣品。結(jié)果，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液及對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)。缺黃芩陰性樣品均對(duì)相應(yīng)樣品測(cè)定無(wú)干擾，且6批樣品及相應(yīng)陰性樣品的結(jié)果均一致（圖2 A）。

炙甘草：取樣品細(xì)粉5 g，加乙醚40 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，棄去醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺炙甘草陰性樣品5 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液。取甘草酸銨對(duì)照品制成每1 mL約含1 mg的對(duì)照品溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502中薄層色譜法[4]，分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液及對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一含1%氫氧化鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。1～6號(hào)樣品分別做相應(yīng)的陰性樣品。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液及對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)。缺甘草陰性樣品均對(duì)相應(yīng)樣品測(cè)定無(wú)干擾，且6批樣品及相應(yīng)陰性樣品的結(jié)果均一致（圖2 B）。

圖2 薄層色譜圖

2.3 大黃含量測(cè)定

2．3．1 溶液制備

取供試品細(xì)粉3 g，精密稱定，混勻，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，水浴加熱回流1 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取大黃素、大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各約含50 μg的混合溶液，即得混合對(duì)照品溶液。取缺大黃陰性樣品細(xì)粉，與供試品溶液同法制成缺大黃陰性對(duì)照品溶液。

2．3．2 色譜條件[5]與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0．1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～15 min時(shí)71%A→71%A，15～45 min時(shí) 71%A→85%A）；流速：1．0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。6 批樣品和相應(yīng)陰性樣品同法測(cè)定。在此色譜條件下，供試品溶液中大黃素、大黃酚均能得到較好地分離，陰性樣品無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖3。

2．3．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取大黃素（51．2 μg/mL）、大黃酚（49．8 μg/mL）混合對(duì)照品溶液 1，2，5，10，20，25 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為，大黃素Y=2．895X-0．021（r=0．999 8），大黃酚Y=3．958X-7．062（r=0．999 8）。結(jié)果表明，大黃素、大黃酚進(jìn)樣量分別在51．2～1280．0ng和49．8～1 250．0 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖3 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果大黃素、大黃酚的RSD分別為 0．51%和0．27%(n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取6號(hào)樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果大黃素和大黃酚峰平均含量分別為0．33 mg/g和0．69 mg/g，RSD分別為0．91%和 1．24%(n=6），表明方法重復(fù)性良好。

專屬性試驗(yàn)：陰性干擾試驗(yàn)，按處方配比制成缺大黃陰性樣品，依法制備陰性樣品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在大黃素、大黃酚處未出現(xiàn)色譜峰，（圖3），缺大黃陰性樣品無(wú)干擾。峰純度檢查，試驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品中大黃素、大黃酚峰進(jìn)行了色譜峰純度檢查，均未檢測(cè)到雜質(zhì)。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的6號(hào)樣品9份，精密加入大黃素、大黃酚對(duì)照品溶液，按2．3．1項(xiàng)下方法制備溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批3號(hào)樣品制備的供試品溶液，分別于 0，1，2，4，6，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣 10 μL。結(jié)果大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0．47%和 0．58%(n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．3．4 樣品含量測(cè)定

取1～6號(hào)樣品，按2．3．1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 大黃素和大黃酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

2.4 連翹含量測(cè)定

2．4．1 溶液制備

取6號(hào)樣品細(xì)粉3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，浸漬過(guò)夜，超聲處理(功率為 250 W，頻率為 40 kHz）25 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，蒸至近干，加中性氧化鋁1%拌勻，加在中性氧化鋁柱（100～120 目，1 g，內(nèi)徑為 1～1．5 cm）上，用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0% 甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[6]。取連翹苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL約含50 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取缺連翹陰性樣品細(xì)粉，與供試品溶液同法制成缺連翹陰性對(duì)照品溶液。

2．4．2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0．1%磷酸溶液（22 ∶78）；流速：1．0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm。6批樣品和相應(yīng)陰性樣品同法測(cè)定。在該色譜條件下，供試品溶液中連翹苷能得到較好地分離，陰性樣品無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖4。

2．4．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取連翹苷（54．8 μg/mL）對(duì)照品溶液 1，2，5，10，20，25 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=6．293X-0．232，r=0．999 9(n=6）。結(jié)果表明，連翹苷進(jìn)樣量在54．8～1 370．0 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖4 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果連翹苷的RSD為0．45%(n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取6號(hào)樣品6份，按2．4．1下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果連翹苷平均含量為0．90 mg/g(n=6），表明方法重復(fù)性良好。

專屬性試驗(yàn)：陰性干擾試驗(yàn)，按處方配比制成缺連翹陰性樣品，依法制備陰性樣品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，在連翹苷峰處未出現(xiàn)色譜峰(圖4），說(shuō)明按本試驗(yàn)條件測(cè)定，缺連翹陰性樣品無(wú)干擾。峰純度檢查，試驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品中連翹苷峰進(jìn)行了色譜峰純度檢查，均未檢測(cè)到雜質(zhì)。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的6號(hào)樣品9份，精密加入連翹苷對(duì)照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 連翹苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批3號(hào)樣品制備的供試品溶液，分別于 0，1，2，4，6，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣 10 μL。結(jié)果連翹苷峰面積的RSD為0．68%(n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．4．4 樣品含量測(cè)定

取1～6號(hào)樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果樣品編號(hào)為1～6 的連翹苷的含量分別為 0．783，0．654，0．492，0．922，0．556，0．920 mg/g。

3 討論

由于本試驗(yàn)樣品均是自制混合細(xì)粉，故顯微鑒別、薄層色譜鑒別及含量測(cè)定的每個(gè)批次的陽(yáng)性樣品均對(duì)應(yīng)一個(gè)陰性樣品，以排除陰性干擾。結(jié)果表明，所有批次的陰性樣品對(duì)在方法學(xué)考察下的陽(yáng)性樣品均無(wú)干擾，表明方法可行、可靠。

薄層色譜鑒別考察因素包括不同廠家的硅膠G預(yù)制板、不同的溫濕度、展開(kāi)系統(tǒng)及飽和度，以及樣品處理等。不同廠家的硅膠粒度、性質(zhì)、黏合劑和制版技術(shù)都會(huì)導(dǎo)致色譜行為產(chǎn)生差異。溫度高，一般Rf值也高。溫度還影響有機(jī)試劑的蒸發(fā)程度，從而改變了展開(kāi)劑的比例。濕度影響薄層板的吸附能力，樣品的提取決定了斑點(diǎn)之間能否達(dá)到滿意的分離效果[7]。結(jié)果表明，甘草薄層色譜鑒別在室溫15℃、相對(duì)濕度50%的條件下，用默克公司的預(yù)制板能達(dá)到較好的分離度，且展開(kāi)缸和薄層板是否飽和對(duì)甘草薄層鑒別影響較大。黃芩色譜鑒別若采用2015年版《中國(guó)藥典（一部）》的方法，不僅會(huì)造成嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，且陰性樣品干擾，達(dá)不到鑒別效果。黃芩色譜鑒別對(duì)硅膠G板的選擇性不強(qiáng)，在室溫15℃、相對(duì)濕度50%的條件下，青島海洋公司和默克公司的硅膠G預(yù)制板都能很好地分離，甲酸能很好地抑制斑點(diǎn)的拖尾現(xiàn)象。

含量測(cè)定方法研究過(guò)程中，大黃的總蒽醌含量遠(yuǎn)高于游離蒽醌，采用酸水解考察總蒽醌含量應(yīng)更合理[8-9]，但在方法考察的過(guò)程中，由于酸水解過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物對(duì)大黃酸及大黃素峰位置均有干擾，且酸水解的酸度和時(shí)間對(duì)蒽醌苷元有影響[10]，故僅考慮游離蒽醌的含量測(cè)定。游離蒽醌的測(cè)定過(guò)程中，大黃酸峰位置干擾明顯，大黃素甲醚含量較低且保留時(shí)間較長(zhǎng)，故只考察大黃素及大黃酚的含量測(cè)定。提取過(guò)程考察了浸泡1 h后超聲提取30 min和60 min或加熱回流提取1 h和2 h，并進(jìn)行方法學(xué)考察和耐用性試驗(yàn)。流動(dòng)相參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》大黃品種項(xiàng)下方法。不同品牌色譜柱[Agilent Ecilpse Plus C18柱，Waters Symmetry C18柱，Purospher Star(Merck）]和不同品牌的液相色譜儀器（戴安U3000，沃特世e2695），測(cè)得大黃中大黃素、大黃酚的RSD均在2．0%之內(nèi)，說(shuō)明本方法測(cè)定耐用性好。設(shè)計(jì)連翹苷的含量來(lái)控制連翹的質(zhì)量。連翹的品質(zhì)雖分為青翹和老翹，但藥典中規(guī)定連翹苷的限度一致，而市場(chǎng)上流通的老翹中連翹苷的含量很難達(dá)到藥典限度[11]，故設(shè)定連翹苷的含量來(lái)控制連翹的品質(zhì)很有必要。連翹苷的含量測(cè)定方法研究中，提取方法參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》連翹品種項(xiàng)下方法，流動(dòng)相考察乙腈-水和乙腈-0．1%磷酸溶液。不同品牌色譜柱[Agilent Ecilpse Plus C18柱，Waters Symmetry C18柱，Purospher Star(Merck）]和不同品牌的液相色譜儀（戴安U3000，沃特世e2695），測(cè)得連翹中連翹苷的RSD在2．0%之內(nèi)，說(shuō)明本方法測(cè)定耐用性好。