楊曉莉，李 輝 ，許華玉 ，王似錦，繩金房

（1．陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065； 2．國家藥典委員會(huì)，北京 100061；3．中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

水分活度(aw）是評(píng)價(jià)食品和化妝品微生物風(fēng)險(xiǎn)和產(chǎn)品穩(wěn)定性的重要依據(jù)，但在制藥工業(yè)中使用水分含量反映藥品質(zhì)量安全和穩(wěn)定還是一個(gè)相對(duì)較新的概念[1]。aw與微生物的生長密切相關(guān)，而微生物指標(biāo)是反映藥品安全性和有效性的重要指標(biāo)，通過測定aw可更好地反映藥品質(zhì)量[2]。2015年版《中國藥典》整合了先進(jìn)理念，借鑒了國外藥典的先進(jìn)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，兼顧國情對(duì)非無菌制劑微生物限度檢查法等內(nèi)容做了較大修訂[3]，但在非無菌制劑微生物控制相關(guān)指導(dǎo)原則方面還不完善，僅收載了水分測定方法[4]，尚未收載aw測定在非無菌制劑中的應(yīng)用指導(dǎo)原則，仍與《美國藥典》(USP）存在一定差距[5]，這一現(xiàn)狀與我國《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）強(qiáng)調(diào)的藥品源頭控制和過程控制要求不相適應(yīng)[6]。因此，亟需制訂相應(yīng)的指導(dǎo)原則，以提高藥品微生物污染的源頭控制和過程控制的可操作性和有效性。

1 概述

1953年，澳大利亞食品微生物學(xué)家Scott[7]研究了30℃下金黃葡萄球菌與aw的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其生長有最低的aw限值，低于該值微生物就不能生長，首次提出了aw的概念[7]。隨后，Christian等[8]研究沙門菌的生長與aw的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律。1957年，Scott[9]對(duì)引起食品腐敗的微生物與aw的關(guān)系進(jìn)行了全面論述，發(fā)現(xiàn)是aw而不是水分含量決定微生物賴以生存的自由水的多少。之后，aw與微生物的關(guān)系便成為微生物科學(xué)家研究的熱門領(lǐng)域[10-13]。1978年，德國食品微生物學(xué)家L．Leistner研究了影響微生物生長的各種因素，提出了柵欄理論，認(rèn)為aw是影響微生物生長的重要柵欄因子之一，aw與其他柵欄因子協(xié)同作用，應(yīng)用于食品的保存[14]。2006 年，USP 29-NF24<1112>首次收載aw測定[15]應(yīng)用于非無菌制劑微生物控制的章節(jié)，將其成功引入制藥工業(yè)藥品微生物控制[15]。

aw是相同溫度下產(chǎn)品水蒸氣壓(P）與純水蒸氣壓(Po）的比值。其在數(shù)值上等于封閉系統(tǒng)中由產(chǎn)品產(chǎn)生的相對(duì)濕度（RH）的1/100。RH可通過直接測量蒸氣分壓或露點(diǎn)的方法獲得，也可通過傳感器間接測量[5]。aw和平衡相對(duì)濕度（ERH）的計(jì)算關(guān)系為ERH(%）=aw×100%。

2 水分活度與微生物控制原理

2.1 微生物生長的最低 aw

微生物生長環(huán)境中可利用的水分是其生長的必要條件，而aw表示產(chǎn)品中水的一種能量狀態(tài)[16]，反映水與產(chǎn)品組分之間結(jié)合的緊密程度，是微生物賴以生存的自由水的量度。aw介于0～1。數(shù)值越大，表示水的自由程度越高，越容易被微生物利用；數(shù)值越小，表示水的自由程度越低，水與產(chǎn)品組分之間結(jié)合得越緊密越難被微生物利用。aw與微生物的生長密切相關(guān)，在控制微生物生長繁殖方面起著重要作用。

通常物質(zhì)中的水被分為自由水（或游離水）和結(jié)合水。微生物需要自由水進(jìn)行新陳代謝活動(dòng)，如細(xì)菌細(xì)胞只能通過細(xì)胞壁傳遞營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物必須是可溶形式以滲透細(xì)胞壁[17]。當(dāng)微生物細(xì)胞處于低aw時(shí)，由于滲透作用，水傾向于流出細(xì)胞，如果細(xì)胞無法調(diào)節(jié)水的平衡，細(xì)胞生長將會(huì)被抑制甚至死亡[18]。而aw是“自由水”的量度，因此用于反映微生物的生長繁殖，aw是比水分含量更有效的參數(shù)。微生物的生長活動(dòng)只發(fā)生在一定aw范圍內(nèi)，其生長都有最低限值，低于了這個(gè)限值微生物就不能生長。不同微生物生長的最低aw需求不同。一般來說，革蘭陰性菌包括與藥品質(zhì)量密切相關(guān)的控制菌，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌等在aw低于0．91的產(chǎn)品中不會(huì)生長繁殖，革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌在aw低于0．86不會(huì)生長繁殖，黑曲霉在aw0．77以下不會(huì)生長繁殖，所有微生物在aw低于 0．60時(shí)不會(huì)增殖[5]。

產(chǎn)品中的aw降低意味著微生物可利用的自由水減少，微生物的新陳代謝困難。許多微生物通過細(xì)胞調(diào)節(jié)可在低aw條件下存活，但不能生長。隨著aw的降低將導(dǎo)致微生物生長停滯期的延長，生長速率減慢和菌落數(shù)量減少[16]，圖1顯示了不同aw對(duì)金黃色葡萄球菌生長曲線和最大菌落數(shù)量的影響[19]。產(chǎn)品中細(xì)菌、酵母菌和霉菌的萌發(fā)、新陳代謝、繁殖和生存需要可利用水，基于這樣的規(guī)律，可利用aw這一重要參數(shù)預(yù)測產(chǎn)品中潛在微生物生長繁殖的能力和潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。

圖1 不同 aw對(duì)金黃色葡萄球菌生長曲線和最大菌落數(shù)量的影響

2.2 aw是微生物生長的柵欄因子

aw的研究源于食品，在食品中的應(yīng)用也較為成熟。柵欄技術(shù)認(rèn)為aw是諸多影響微生物生長的重要柵欄因子之一。柵欄技術(shù)把高溫、低溫、控制aw、調(diào)節(jié)pH、采用輻照、控制氧化-還原電位、添加抑菌劑等歸納成單獨(dú)柵欄因子，并提出食品防腐就是調(diào)控這些因子，打破微生物內(nèi)平衡，從而限制微生物的生長繁殖[14]。這些因子相互作用形成了特殊的防止食品腐敗變質(zhì)的柵欄，對(duì)食品的防腐保持聯(lián)合作用及柵欄效應(yīng)。柵欄因子間的相互作用及與食品中微生物的相互作用的結(jié)果，不僅是這些因子單獨(dú)效應(yīng)的簡單累加，而且也是協(xié)同作用，這種效應(yīng)稱作柵欄效應(yīng)（hurdle effect）[20-21]?？刂芶w，對(duì)于中等含水量和高含水量食品保藏具有重大意義。在食品儲(chǔ)藏中，初始載荷微生物應(yīng)當(dāng)不能克服最初的柵欄因子，否則食品就會(huì)腐敗變質(zhì)，甚至引發(fā)食物中毒。通過柵欄技術(shù)使食品本身具有一定的抑菌能力，可以使食品的微生物特性穩(wěn)定，使得儲(chǔ)藏的食品更安全[22]。

柵欄技術(shù)應(yīng)用于食品保存的6個(gè)案例[23]（圖2）可幫助理解aw對(duì)于微生物生長的重要意義。柵欄因子的組合將增加不利于食品中潛在微生物的生長，并增加微生物生長的滯后期，如果微生物的生存環(huán)境持續(xù)抑制其生長繁殖，滯后期無限延長，將致使微生物死亡[24]。

圖2 6個(gè)食品保存案例柵欄效應(yīng)分析

3 aw在藥品微生物控制中的應(yīng)用現(xiàn)狀

相比藥品，食品中富含豐富的營養(yǎng)成分，更適合微生物的生長繁殖，aw在食品工業(yè)中的成功應(yīng)用，為非無菌制劑的微生物控制提供了值得借鑒的新方法。USP<1112>中提到的“水分活度的測定在非無菌制劑中的應(yīng)用”，為非無菌制劑的微生物控制提供了一個(gè)有力的應(yīng)用指導(dǎo)原則。相比微生物限度檢查，aw測定可以更快[25]、更準(zhǔn)確地預(yù)測微生物對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性和安全性的影響。同時(shí)，aw也和產(chǎn)品的化學(xué)和物理穩(wěn)定性有直接關(guān)系。通過對(duì)藥品aw的測定和分析，不但可篩選出更合理的處方，同時(shí)還能預(yù)測藥品潛在的微生物風(fēng)險(xiǎn)。

然而，aw測定在藥品微生物控制中的應(yīng)用還是一個(gè)較新的領(lǐng)域，通過其可以反映藥品潛在微生物生長狀況及評(píng)估安全風(fēng)險(xiǎn)，近年來逐漸受到重視。一些制藥公司已利用aw控制微生物生長的理念開發(fā)新藥，可節(jié)省成本，優(yōu)化微生物限度檢查方案。如美國輝瑞制藥有限公司應(yīng)用aw預(yù)測生產(chǎn)過程中溶液中微生物的生長或抑制，創(chuàng)建溶液類型，以確定溶液的有效期，節(jié)省時(shí)間-費(fèi)用成本[26]。葛蘭素史克公司在新藥開發(fā)時(shí)，將aw作為穩(wěn)定性計(jì)劃的一部分進(jìn)行測試，以確保包裝產(chǎn)品在特定儲(chǔ)存溫度和濕度下的質(zhì)量穩(wěn)定，滿足安全性標(biāo)準(zhǔn)和有效期要求[27]，為研發(fā)和商業(yè)應(yīng)用提供優(yōu)化的微生物限度檢查和抑菌效力檢查測試計(jì)劃節(jié)省大量資源和成本，提高了效率[28]。

目前，制藥企業(yè)存在對(duì)藥品過度防護(hù)和依賴終端檢驗(yàn)的情況，微生物污染風(fēng)險(xiǎn)管理水平較薄弱，過程控制手段缺失。aw是影響微生物生長的關(guān)鍵因素，影響著藥品的安全性和有效性，對(duì)其測定是進(jìn)行藥品生產(chǎn)的過程控制和參數(shù)放行的必要手段，值得深入研究和應(yīng)用。

4 aw在藥品微生物控制中的應(yīng)用前景

在制藥工業(yè)中，非無菌制劑aw與以下方面有關(guān)：1）藥品處方及抑菌體系的抑菌有效性；2）藥品處方中易于化學(xué)水解的活性藥物成分的降解；3）藥品處方(尤其是液體、膏、乳液和霜）易受微生物污染的程度；4）提供了減少微生物限度檢查，依照通則非無菌制劑微生物限度檢查法篩查藥品有效性、穩(wěn)定性和控制菌釋放的理論依據(jù)[5]。不同aw藥品中的微生物生存行為對(duì)于藥品微生物控制非常重要，低aw會(huì)防止微生物在藥品上的生長繁殖。在科學(xué)的微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基礎(chǔ)上，可根據(jù)aw設(shè)置有針對(duì)性的個(gè)性化微生物控制方案，如全面的微生物限度檢查或減少日常檢查。應(yīng)注意的是，使用aw進(jìn)行微生物控制，必須遵循嚴(yán)格的GMP，以確保微生物的最低負(fù)荷。USP<1112>提供了藥品處方對(duì)微生物污染影響的指導(dǎo)，降低藥品aw對(duì)預(yù)防潛在微生物的增殖大有裨益；非無菌制劑的處方，生產(chǎn)步驟和測試應(yīng)反映這一參數(shù)。

當(dāng)前符合GMP生產(chǎn)要求的藥品aw較低，沒有或幾乎沒有微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，在此情況下，日常進(jìn)行的微生物限度檢查沒有必要。由于非水性液體制劑或固體藥劑為低aw，不支持孢子萌發(fā)和微生物生長，其微生物監(jiān)控頻率決定于產(chǎn)品的歷史測試數(shù)據(jù)和原料、水、生產(chǎn)過程的微生物污染控制的有效性證明[28]。在科學(xué)的微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基礎(chǔ)上，采用aw測定進(jìn)行微生物監(jiān)控，建立合理的微生物控制策略、設(shè)計(jì)性能優(yōu)良的藥品對(duì)于節(jié)約成本、提高效率、提升產(chǎn)品質(zhì)量具有重要指導(dǎo)意義。

國際人用藥品標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)組織（ICH）Q6A的決策樹6#原料藥和輔料的微生物檢查（圖3）和8#非無菌藥品的微生物檢查（圖4）[29-30]，是低aw的非無菌原料藥和輔料及非無菌制劑可不進(jìn)行批批微生物限度檢查的重要技術(shù)指導(dǎo)原則[28]。我國于2017年正式加入ICH，意味著中國的藥品監(jiān)管部門、制藥行業(yè)和研發(fā)機(jī)構(gòu)將逐步轉(zhuǎn)化和實(shí)施國際科學(xué)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和指南，并積極參與規(guī)則制訂，將推動(dòng)國際創(chuàng)新藥品早日進(jìn)入中國市場，滿足臨床用藥需求，同時(shí)提升國內(nèi)制藥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新能力和國際競爭力[31]。在新形勢下研究國外藥品微生物控制方面的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于優(yōu)化產(chǎn)業(yè)升級(jí)、節(jié)約資源及逐步提高我國藥品的國際競爭力具有現(xiàn)實(shí)意義。應(yīng)用aw控制藥品生產(chǎn)過程的微生物生長是微生物控制發(fā)展的必然趨勢。應(yīng)重視aw在藥品研發(fā)階段參與處方篩選，評(píng)估藥品的微生物風(fēng)險(xiǎn)，設(shè)計(jì)出低微生物風(fēng)險(xiǎn)的藥品，不是依賴檢驗(yàn)進(jìn)行藥品的微生物控制，而是質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念的必然要求。然而，我國藥品領(lǐng)域尚未建立aw測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，利用aw控制微生物生長的應(yīng)用仍為空白。因此，亟待制訂符合國情和發(fā)展需要的非無菌制劑aw的測定應(yīng)用指導(dǎo)原則，以推動(dòng)我國藥品微生物控制的發(fā)展。

圖3 ICH Q6A決策樹6#（原料藥和輔料的微生物檢查）

圖4 ICH Q6A決策樹8#（非無菌藥品的微生物檢查）