姚秀香，王 武,*，李沛軍，周 穎，童紅甘，張華鋒，葉 鍵

（1.合肥工業(yè)大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230001；2.安徽先知緣食品有限公司，安徽 桐城 231400）

桐城風鴨產(chǎn)于安徽桐城地區(qū)，它是由當?shù)貍鹘y(tǒng)的手工工藝，在自然條件下，低溫腌制、風干而成的一種傳統(tǒng)腌臘肉制品。風鴨貯藏時間長，蠟香濃郁，回味悠長，常作為款待親友的一道佳肴。國外對傳統(tǒng)腌臘制品的風味研究主要集中在火腿、發(fā)酵香腸等產(chǎn)品[1-2]，而在鴨肉腌臘制品發(fā)酵、風味等方面研究幾乎是空白。我國在風鴨風味方面研究主要側(cè)重于脂肪降解、氧化和蛋白質(zhì)的分解等復雜的化學反應[3]，而微生物對風鴨風味的貢獻關注較少[4]。自然界中的微生物具有強大的酶體系和豐富的代謝產(chǎn)物，可能存在潛在的風味發(fā)酵劑。目前肉類工業(yè)發(fā)酵劑細菌關注較多，主要是乳酸菌和葡萄球菌。乳酸菌[5-7]作為發(fā)酵劑可以降低產(chǎn)品pH值和產(chǎn)生細菌素，有效抑制雜菌，其次乳酸菌代謝的乳酸能與醇類形成香味濃郁的酯類，而凝固酶陰性葡萄球菌[8-10]作為發(fā)酵劑能抑制生物胺，有效代替亞硝酸鹽，提高產(chǎn)品安全性，并形成很好的發(fā)酵風味。此外，研究表明酵母和霉菌能夠在制酒、醬油等產(chǎn)品中產(chǎn)生重要風味，利用釀酒酵母菌、黑曲霉菌、米曲霉制作微生物飼料，有效提高畜禽產(chǎn)品品質(zhì)、改善肉類風味。在醬豬蹄中加入米曲霉、黑曲霉，得到外觀風味好、保質(zhì)期長的產(chǎn)品[11-12]。一方面，酵母菌和霉菌真菌可能產(chǎn)生酯類化合物，賦予傳統(tǒng)干香腸的水果香味[13]。另一方面，真菌在傳統(tǒng)香腸中的潛在發(fā)酵作用尚未確定[14-15]。本研究從桐城風鴨中篩選產(chǎn)香真菌，分析產(chǎn)香菌株的揮發(fā)性代謝風味產(chǎn)物，以期為新型肉制品發(fā)酵劑的開發(fā)及桐城風鴨風味形成機制提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桐城風鴨由安徽先知緣食品有限公司提供。

Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Ezup柱式酵母基因組、DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯 家樂福超市。

1.2 儀器與設備

S C I O N S Q四極桿氣相色譜-質(zhì)譜（g a s chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀美國布魯克公司；SCIENTZ-09型無菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；DYY-6D型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；MINI4-UV型實驗室純水機科爾頓中國有限公司；2720thermalcycler型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、3730XL型測序儀 美國應用生物系統(tǒng)公司；FR980型凝膠成像儀上海復日科技儀器有限公司；DYCP-31DN型DNA電泳槽、DYY-5型穩(wěn)壓電泳儀 北京六一儀器廠；CAR/PDMS固相微萃取針、57330U型固相微萃取手柄 美國Supelco公司；FINNPIPETTE F3移液器 美國Thermo Fisher公司；DB-5MS毛細管色譜柱 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)香菌株感官篩選標準

產(chǎn)香菌株感官篩選標準在文獻[16]方法的基礎上，稍作修改和補充，如表1所示。

表1 產(chǎn)香菌株感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of aroma-producing fungi

1.3.2 產(chǎn)香菌株的分離純化

參考GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》[17]。將風干后的鴨腿置于超凈工作臺上，按照無菌操作要求，用無菌解剖刀去骨后剪碎，四分法稱取25 g樣品加入225 mL 0.85%無菌生理鹽水置于無菌均質(zhì)袋中，用拍打式均質(zhì)器拍打2 min，制成1∶10的樣品勻液，備用。用1 mL微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，注入9 mL稀釋液的無菌試管中，振蕩混勻，制成1∶100的樣品勻液，依次制備10 倍系列稀釋樣品勻液。換用100 μL微量移液器移取適宜的3～4 個質(zhì)量濃度梯度鴨肉菌懸液100 μL分別涂布于孟加拉紅平板中，每組3 個平行，與此同時，吸取100 μL無菌生理鹽水加入3 個無菌平板內(nèi)作空白對照，30 ℃培養(yǎng)5 d。根據(jù)菌落的顏色、形態(tài)、光澤等特點挑選出不同的霉菌、酵母，轉(zhuǎn)到新的平板上繼續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)平板劃線，連續(xù)純化3 代后，將純化后的菌落純培養(yǎng)物接種試管斜面，于-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 揮發(fā)性風味代謝產(chǎn)物分析

考慮菌株在不同的培養(yǎng)體系下可能會產(chǎn)生不同的代謝風味，經(jīng)優(yōu)化改良后的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基被作為肉模擬體系的理想培養(yǎng)基[18]，實驗將純化后的菌株分別接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和模擬肉體系中，并將未接種菌株的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和模擬肉體系作為對照組，培養(yǎng)5 d，移取3 mL置于聚四氟乙烯密封的樣品瓶中，將75 μm CAR/PDMS萃取頭安裝入手柄后，插入聚四氟乙烯密封的10 mL樣品瓶中，緩慢推出纖維頭，使其暴露在樣品上部的頂空中，并與樣品保持一定距離，60 ℃水浴吸附40 min[19]，將萃取頭插入GC進樣口，250 ℃解吸2 min，推回纖維頭，拔出萃取針頭，進行GC分析，采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS檢測揮發(fā)性代謝風味產(chǎn)物。

1.3.4 GC-MS條件

GC條件：DB-5MS毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm）；進樣口溫度與接口溫度均為250 ℃，程序升溫：柱初溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min上升至60 ℃；再以10 ℃/min上升至100 ℃；接著以18 ℃/min上升至240 ℃保持6 min，檢測溫度240 ℃。載氣為He，流速0.3 mL/min；恒壓35 kPa，不分流[19]。

MS條件：離子源溫度200 ℃；電子電離離子源；電子能量70 eV；燈絲電流150 μA；質(zhì)量掃描范圍m/z 33～450[19]。

1.3.5 化合物定性

利用美國布魯克GC-MS solution工作站與NIST 11 library數(shù)據(jù)庫檢索，匹配度達到800以上，確定其化合物。

1.3.6 分子學鑒定

基因組D N A提取按真菌和酵母提取試劑盒操作。P C R擴增霉菌I T S測序[20]，引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。酵母26S rDNA測序[21]，引物NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG；NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG，序列5’→3’。PCR體系：Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL；10×Buffer（Mg2+）2.5 μL；dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL；酶0.2 μL；F（10 μmol/L）0.5 μL；R（10 μmol/L）0.5 μL；加雙蒸水至25 μL。PCR循環(huán)條件[22]：94 ℃保持4 min，預變性；94 ℃保持45 s，55 ℃保持45 s，72 ℃保持1 min，循環(huán)30次；72 ℃保持10 min，修復延伸；4 ℃∞終止反應。1×TAE緩沖溶液，1%瓊脂糖電泳，5 μL PCR產(chǎn)物，150 V、100 mA、20 min電泳觀察，PCR產(chǎn)物的測序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。將測序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站用BLAST程序進行序列比對，用軟件MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用美國布魯克GC-MS solution工作站自帶軟件對原始數(shù)據(jù)進行繪圖并截圖，PhotoShop CC（2017版）軟件對圖像進行組合和標注，MEGA 6.0軟件構(gòu)建生物系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香菌株的篩選

表2 產(chǎn)香酵母菌株的篩選Table 2 Screening of aroma-producing yeast Y1

采用孟加拉紅培養(yǎng)基分離桐城風鴨中的酵母菌，根據(jù)酵母的菌落形態(tài)分離出3株氣味良好的酵母，將不同的酵母純化后轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)5 d，每隔1 d進行感官評價，實驗結(jié)果如表2所示，與未接種菌株的空白組進行香氣比對，接種酵母Y1菌株的培養(yǎng)基產(chǎn)青草香、醇香，確定酵母Y1菌株代謝風味產(chǎn)物具有青草香、醇香類風味物質(zhì)。

表3 產(chǎn)香霉菌菌株的篩選Table 3 Screening of aroma-producing mold M3

采用孟加拉紅培養(yǎng)基對桐城風鴨中的霉菌進行分離，根據(jù)霉菌的菌落形態(tài)和感官評價，分離純化出6株氣味良好的霉菌，將純化后的霉菌轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)7 d，每隔1 d進行感官評價，結(jié)果如表3所示，與未接種菌株的空白組進行香氣比對，接種霉菌M3菌株的培養(yǎng)基產(chǎn)酯香，初步確定霉菌M3菌株代謝風味產(chǎn)物具有酯香類風味物質(zhì)。

2.2 產(chǎn)香菌株的形態(tài)學特征

圖1 產(chǎn)香菌株M3（A）和產(chǎn)香菌株Y1（B）的形態(tài)圖Fig. 1 Morphology of mold M3 (A) and yeast Y1 (B)

選用孟加拉紅和PDA培養(yǎng)基篩選、分離桐城風鴨中產(chǎn)香真菌，得到1株產(chǎn)香酵母Y1和產(chǎn)香霉菌M3，由圖1可知，產(chǎn)香菌株M3菌絲體發(fā)達，呈現(xiàn)白色絨毛狀，可初步確定為霉菌菌株。此外，實驗發(fā)現(xiàn)M3菌株在常溫和4 ℃低溫下生長，能夠在桐城風鴨的生產(chǎn)工藝中存活，生長周期在1周左右，且隨著菌株的生長，酯香味越來越濃郁。產(chǎn)香菌株Y1在孟加拉紅培養(yǎng)基內(nèi)呈現(xiàn)玫紅色，且菌落比細菌大，生長周期長，初步確定為酵母菌株，篩選過程中發(fā)現(xiàn)Y1菌株生長周期在5 d左右，培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的青香味濃郁，綜上，2株菌株均有作為發(fā)酵菌株的潛力。

2.3 產(chǎn)香菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析

圖2 產(chǎn)香酵母Y1在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系下的揮發(fā)性代謝風味的GC-MS譜圖Fig. 2 Volatile fl avor components from yeast Y1 cultured in PDA medium identi fi ed by GC-MS

采用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS法測定產(chǎn)香酵母Y1在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系下的揮發(fā)性代謝風味產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示。與對照組相比，產(chǎn)香酵母Y1在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系下，出現(xiàn)1-戊醇和苯乙醇兩個吸收峰。孫寶國[23]研究表明1-戊醇香氣閾值為4 000 μg/kg，帶有面包香、酒香和果香；而苯乙醇具有新鮮面包香、清甜的玫瑰樣花香，這種香味描述與實驗結(jié)果一致，因此，產(chǎn)香酵母Y1在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系下代謝產(chǎn)生的青香味來自于1-戊醇和苯乙醇2種風味物質(zhì)的共同作用。

圖3 產(chǎn)香酵母Y1在模擬肉體系下的揮發(fā)性代謝風味的GC-MS譜圖Fig. 3 Volatile fl avor components from yeast Y1 cultured in model meat system identified by GC-MS

考慮菌株在不同的培養(yǎng)體系下可能會產(chǎn)生不同的代謝風味，研究產(chǎn)香酵母Y1在模擬肉體系下的揮發(fā)性風味變化，采用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS法測定產(chǎn)香酵母Y1在模擬肉體系下的揮發(fā)性代謝風味產(chǎn)物，結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，產(chǎn)香酵母Y1在模擬肉體系下同樣發(fā)現(xiàn)1-戊醇和苯乙醇2種風味物質(zhì)吸收峰。實驗過程中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)香酵母Y1能有效改善模擬肉體系的風味，進一步推斷這種風味的改變來自于1-戊醇和苯乙醇2種風味物質(zhì)的共同作用。

通過對比馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系和模擬肉體系下?lián)]發(fā)性代謝風味變化，進一步確定從桐城風鴨中篩選得到的產(chǎn)香酵母Y1能夠產(chǎn)生1-戊醇和苯乙醇2種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，1-戊醇被認為是蟹肉、兔肉、豬肉、魚肉和風干鴨肉等多種肉制品中的揮發(fā)性風味化合物[24]，將戊醇與醛類、酮類共同制作液體香精添加到食品或肉味香精中，能有效地提升其脂肪香氣[25]。苯乙醇具有玫瑰香，廣泛應用于釀酒工業(yè)、化妝品和香料中[26]，余冰等[27]研究認為苯乙醇是發(fā)酵肉制品的主體風味成分，產(chǎn)香酵母Y1有作為生物生產(chǎn)1-戊醇、苯乙醇的開發(fā)潛力，這將對桐城風鴨風味形成機制的探究提供一定的理論依據(jù)。

圖4 產(chǎn)香霉菌M3在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系下的揮發(fā)性代謝風味的GC-MS譜圖Fig. 4 Volatile fl avor components from mold M3 cultured in PDA system identi fi ed by GC-MS

采用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS法測定產(chǎn)香霉菌M3在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系下的揮發(fā)性代謝風味產(chǎn)物，結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，實驗組接種產(chǎn)香霉菌M3后出現(xiàn)γ-癸內(nèi)酯這種風味物質(zhì)的吸收峰，且在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系下接種產(chǎn)香霉菌M3后苯甲醛吸收峰明顯高于對照組。孫寶國[23]研究表明苯甲醛具有甜的果香、堅果香和花香，而γ-癸內(nèi)酯具有蠟香、果香、奶油香、桃子香和椰子香氣，這與實驗中觀察的酯香味一致，因此，產(chǎn)香霉菌M3在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系下產(chǎn)生的酯香味來自于苯甲醛吸收峰的增強和γ-癸內(nèi)酯物質(zhì)的出現(xiàn)。有研究表明[28]，苯甲醛賦予牛肉的堅果風味更易被消費者接受，此外，苯甲醛多次在鴨肉中檢測出[29]。研究表明[30]苯甲醛在大蒜揮發(fā)性風味物質(zhì)的1.35%，這被認為是肉制品中因生產(chǎn)工藝引入苯甲醛的一種途徑；實驗中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)香霉菌M3同樣能增強苯甲醛吸收峰的強度，相關研究表明霉菌存在多酚氧化酶[31]，這將可能是肉制品中苯甲醛吸收峰出現(xiàn)的另一種途徑。綜上，肉制品中的苯甲醛是來自加工工藝還是微生物的作用，以及產(chǎn)香霉菌M3如何增強苯甲醛吸收峰的形成機制，需要進一步論證，這將對桐城風鴨風味形成機制的探究提供一定的理論參考。

圖5 產(chǎn)香霉菌M3在模擬肉體系下的揮發(fā)性代謝風味的GC-MS譜圖Fig. 5 Volatile fl avor components from mold M3 cultured in model meat system identified by GC-MS

為進一步探究產(chǎn)香霉菌M3在不同體系下的風味變化，采用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS法測定產(chǎn)香霉菌M3在模擬肉體系下的揮發(fā)性代謝風味產(chǎn)物，結(jié)果如圖5所示。與對照組相比，產(chǎn)香霉菌M3在模擬肉體系下同樣出現(xiàn)苯甲醛吸收峰的增強，并且出現(xiàn)γ-癸內(nèi)酯新的吸收峰。實驗過程中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)香霉菌M3能有效改善模擬肉體系的風味，接種產(chǎn)香霉菌M3同樣能夠在肉模擬體系中產(chǎn)生酯香味，進一步確定這種風味的改變來自于苯甲醛和γ-癸內(nèi)酯2種揮發(fā)性香氣物質(zhì)的共同作用。通過對比馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系和模擬肉體系下?lián)]發(fā)性代謝風味變化，進一步確定從桐城風鴨中篩選得到的產(chǎn)香霉菌M3能夠產(chǎn)生苯甲醛和γ-癸內(nèi)酯2種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，γ-癸內(nèi)酯是在香料工業(yè)中普遍應用的一種風味物質(zhì)[32]，它對整體肉香味有重要貢獻，是調(diào)配燉煮雞肉風味香精的重要原料[33]。這將對桐城風鴨風味形成機制的探究提供一定的理論依據(jù)。

2.4 分子學鑒定結(jié)果

圖6 產(chǎn)香酵母Y1的26S rDNA（A）和產(chǎn)香霉菌M3的ITS（B）擴增片段凝膠電泳圖Fig. 6 Electrophoresis profiles of amplified 26S rDNA from yeast Y1 (A)and amplified ITS from mold M3 (B)

分別對產(chǎn)香酵母Y1和產(chǎn)香霉菌M3進行26S rDNA和ITS擴增，產(chǎn)香酵母Y1的26S rDNA和產(chǎn)香霉菌M3的ITS擴增片段凝膠電泳結(jié)果如圖6所示。產(chǎn)香酵母Y1和產(chǎn)香霉菌M3條帶大約長度為600 bp。將PCR擴增產(chǎn)物回收測序，結(jié)果表明產(chǎn)香酵母Y1測序片段長度為590 bp，產(chǎn)香霉菌M3測序片段長度為599 bp。將測序后得到的基因序列置NCBI進行BLAST分析，結(jié)果表明產(chǎn)香酵母Y1與涎沫假絲酵母（Candida zeylanoides）序列同源性相似為99%，產(chǎn)香霉菌M3與煙管菌（Bjerkandera）序列同源性相似為100%。

圖7 產(chǎn)香酵母Y1的26S rDNA相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 7 Phylogenetic tree of yeast Y1 and related strains based on 26S rDNA gene sequence

圖8 產(chǎn)香霉菌M3的ITS相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 Phylogenetic tree of mold M3 strain and related strains based on ITS region sequence

使用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，產(chǎn)香酵母Y1的26S rDNA和產(chǎn)香霉菌M3的ITS相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖7、8所示。產(chǎn)香酵母Y1和產(chǎn)香霉菌M3分別與涎沫假絲酵母和煙管菌在發(fā)育樹上聚為一簇，具有較近的進化距離。綜上，Y1酵母經(jīng)26S rDNA核苷酸測序分析鑒定為涎沫假絲酵母菌株，M3霉菌經(jīng)ITS核苷酸測序分析鑒定為煙管菌株。

3 結(jié) 論

選用孟加拉紅和PDA培養(yǎng)基篩選、分離桐城風鴨中的產(chǎn)香真菌，得到1株產(chǎn)香酵母Y1和1株產(chǎn)香霉菌M3。Y1酵母經(jīng)26S rDNA核苷酸測序分析鑒定為涎沫假絲酵母菌株，M3霉菌經(jīng)ITS核苷酸測序分析鑒定為煙管菌株。采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS技術(shù)，分別在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)體系和模擬肉體系下進行這2株產(chǎn)香菌株的揮發(fā)性代謝風味產(chǎn)物分析，結(jié)果表明，該株涎沫假絲酵母在2種體系下產(chǎn)生的青香味可能來自于1-戊醇和苯乙醇2種物質(zhì)的共同作用。而煙管菌在2種體系下產(chǎn)生的酯香味可能來自于苯甲醛和癸內(nèi)酯2種風味物質(zhì)的作用。此外，產(chǎn)香酵母Y1有作為生物生產(chǎn)1-戊醇、苯乙醇的開發(fā)潛力；產(chǎn)香霉菌M3有作為生物生產(chǎn)苯甲醛、γ-癸內(nèi)酯的開發(fā)潛力。