馬麗麗，高雨軒，陳微秋，武靈瑤，張賢勝，余大洋,王國祥

(南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023)

有機(jī)磷阻燃劑(OFRs)具有良好的阻燃性能，被廣泛應(yīng)用于建筑材料、電子產(chǎn)品、塑料制品、家裝飾品和紡織品等產(chǎn)品中。氯代烷基有機(jī)磷阻燃劑(OFRs-Cl)是其中較常見、濃度較高的一類，包括磷酸三(1，3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)、磷酸三(2-氯-丙基)酯(TCPP)和磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)[1]。近年來，隨著OFRs-Cl生產(chǎn)量和使用量的大幅增加，其在大氣、水體、沉積物和土壤等環(huán)境介質(zhì)中均有檢出[2]。KAWAGOSHI等[3]發(fā)現(xiàn)日本廢棄物處理站內(nèi)原水中ρ(TCPP)和ρ(TCEP)為1.0～9 065 μg·L-1，ρ(TDCPP)為0.6～6.265 μg·L-1。OFRs-Cl在魚類、鼠類、鳥類和蚯蚓等生物體內(nèi)及人體頭發(fā)、乳汁、精液、血液和尿液中也有檢出[1]。OFRs-Cl具有神經(jīng)、生殖、基因、致癌和內(nèi)分泌干擾等生物毒性，在環(huán)境中很難通過常規(guī)工藝降解或去除[4]，其中TCPP和TCEP在底棲生物食物鏈暴露中有生物放大現(xiàn)象。歐盟和美國已將OFRs-Cl 列入潛在致癌物名單。

搖蚊幼蟲廣泛存在于各種水體，種類多，分布廣，密度和生物量大(占底棲生物量的70%～80%)，且有易繁殖、生長周期短、對毒物敏感性強(qiáng)等優(yōu)點，是美國國家環(huán)境保護(hù)局(USEPA)和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)推薦的水生態(tài)毒理學(xué)測試物種。目前，國內(nèi)關(guān)于搖蚊研究主要集中在重金屬、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥等污染物對其急性和慢性毒性(完整生命周期)的影響，包括死亡率、半致死濃度(LC50)、羽化率、生長速率、羽化時間、雌雄比、卵筏產(chǎn)量及孵化率觀測指標(biāo)[5-8]，國內(nèi)外關(guān)于OFRs-Cl對搖蚊幼蟲的毒理學(xué)研究鮮見報道。

參照GB/T 27858—2011《化學(xué)品 沉積物-水系統(tǒng)中搖蚊毒性試驗 加標(biāo)于水法》，選取我國常見的搖蚊種類——伸展搖蚊(Chironomusriparius)為研究對象?；诩毙远拘灶A(yù)試驗數(shù)據(jù)，采用不同濃度TDCPP、TCPP和TCEP開展試驗，以存活率、羽化率為表觀指標(biāo)；選擇伸展搖蚊幼蟲體內(nèi)抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量、功能基因〔熱休克蛋白同源物(HSC70)和細(xì)胞色素P450家族(CYP4G)〕表達(dá)量[9-10]，探討搖蚊幼蟲對水體污染的生態(tài)響應(yīng)機(jī)制，為水體沉積物系統(tǒng)健康評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

(1)受試生物：伸展搖蚊四齡幼蟲，其卵塊來自環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，在實驗室人工氣候箱〔溫度：(22±0.2) ℃，t(光照)∶t(黑暗)=16 h∶8 h，濕度：75%〕中繁殖多代。試驗前，為選擇齡期一致的幼蟲，將同期(產(chǎn)卵在同一日)卵塊分裝至同一培養(yǎng)箱，待其生長至四齡期(卵孵化后16 d，體長約為1 cm)，挑選大小一致的幼蟲進(jìn)行急性毒性試驗。生長期間將德彩魚飼料磨碎后用培養(yǎng)液稀釋成溶液飼喂，投放量以每只幼蟲0.25～0.40 mg·d-1計，每隔2 d對幼蟲進(jìn)行一次食物補(bǔ)充。

(2)主要試劑：TCPP、TCEP和TDCPP均為色譜純，購自Sigma-Aldrich公司。SOD、CAT和MDA試劑盒均購自于南京建成生物研究所。助溶劑二甲基亞砜(DMSO)為分析純，由南京晚晴試劑公司提供。RNA提取試劑、目的基因電泳試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR試劑盒均由南京諾唯贊生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

參照GB/T 27858—2011，開展TDCPP、TCPP和TCEP對伸展搖蚊的急性毒性試驗。采用40 μL的DMSO(φ為0.1‰)作為助溶劑加入含有400 mL蒸餾水〔曝氣48 h，ρ(DO)> 50 mg·L-1〕的燒杯中，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果分別配制0.1、1.0和5.0 mg·L-13個濃度梯度的TDCPP、TCPP和TCEP，同時設(shè)置只含助溶劑的對照組。每個燒杯放入20條四齡搖蚊幼蟲，并用醫(yī)用紗布封口，暴露期間不喂食，每個濃度設(shè)置6個平行。將燒杯置于人工氣候箱中〔溫度：(22±0.2) ℃，t(光照)∶t(黑暗)=16 h∶8 h，濕度：75%〕。24 h暴露結(jié)束后，觀察幼蟲死亡和羽化情況，3種OFRs-Cl每個濃度選3個樣品分別進(jìn)行酶活性測定和功能基因表達(dá)分析。

1.3 樣品的制備與分析測定

(1)搖蚊幼蟲組織勻漿液的制備。取16～20條(20條為0.1 g)搖蚊幼蟲，用生理鹽水洗凈后放入1.5 mL離心管中，加入9倍體質(zhì)量的勻漿液，在冰浴中快速搗碎，制成10%的組織勻漿液，并在4 ℃、3 000 r·min-1(相對離心力RCF為5 720)條件下離心10 min，吸取上清液，編號分裝于離心管，存放于-20 ℃冰箱，供不同酶檢測時使用。

(2)蛋白質(zhì)和酶活性測定。蛋白質(zhì)含量、SOD活性、CAT活性和MDA質(zhì)量的測定均依照試劑盒說明書進(jìn)行。

(3)蛋白基因mRNA的RT-qPCR 檢測。按Trizol試劑說明書提取搖蚊幼蟲(挑選15條)組織總RNA，提取后用焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解分裝于-80 ℃ 條件下保存。RNA濃度吸光度采用微量紫外分光光度計測定，數(shù)值均在1.8～2.0之間，說明RNA純度高，之后樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取2 μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作要求進(jìn)行，產(chǎn)物cDNA于-20 ℃條件下保存。兩種功能基因的RT-qPCR檢測采用20 μL體系，包括ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。儀器選用StepOnePlus Real-Time PCR System(ABI，美國)，RT-qPCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性5 s；60 ℃退火10 s；72 ℃延伸采集熒光信號15 s，45個循環(huán)。熔解曲線條件：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。內(nèi)參基因(GAPDH)和2個功能基因(HSC70和CYP4G)檢測引物序列見表1[9-10]。

表1基因RT-qPCR檢測的引物序列[9-10]

Table1PrimersequencesofthegenesusedforRT-qPCRassay

基因登錄號上游引物下游引物產(chǎn)物/bpHSC70AF448434.1CGTGCTATGACTAAGGACAAGCTTCATTGACCATACGT-TC239CYP4GFJ541450.1GACATTGATGAGAATGATGTT-GGTTAAGTGGAACTGGTGGG-TACAT340GAPDHEU999991GGTATTTCATTGAATGAT-CACTTTGTAATCCTTGGATTGCATGTACTTG110

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Origin 8.6軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計及作圖。不同處理組與對照組的比較采用單因素方差分析，顯著性差異水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種OFRs-Cl對搖蚊存活和羽化的影響

表2顯示，暴露24 h后，隨著濃度增加，搖蚊幼蟲存活量呈降低趨勢，各處理組均低于對照組。對照組幼蟲存活率高達(dá)96%，處理組存活率為85%～91%，明顯低于對照組。羽化結(jié)果顯示，搖蚊幼蟲在5.0 mg·L-1的TDCPP和TCEP中暴露24 h后，羽化率分別達(dá)到10%和2.5%，對照組和其他處理組均未見羽化現(xiàn)象。

表23種OFRs-Cl對搖蚊存活和羽化的影響

Table2EffectsofthreeOFRs-ClonsurvivalandemergenceofChironomusriparius

ρ/(mg·L-1)TDCPPTCPPTCEP存活數(shù)羽化數(shù)存活數(shù)羽化數(shù)存活數(shù)羽化數(shù)01150115011500.11070108010901.01060107010505.01021210501063

搖蚊幼蟲數(shù)均為20×6。

2.2 3種OFRs-Cl對搖蚊SOD活性的影響

由圖1可知，在3種添加OFRs-Cl的水體中，相對于對照組，各處理組搖蚊幼蟲體內(nèi)SOD活性均被激活，且TDCPP脅迫下SOD活性與污染物濃度具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。SOD活性隨TDCPP、TCPP和TCEP濃度的增加而逐漸升高，與對照相比，最高濃度處理組受誘導(dǎo)作用最強(qiáng)烈且達(dá)顯著水平(P<0.05)，分別為對照組的2.57、3.05和3.55倍。比較相同濃度TDCPP、TCPP和TCEP發(fā)現(xiàn)，TCEP暴露下?lián)u蚊幼蟲SOD活性均高于其他兩組，在低濃度(0.1 mg·L-1)條件下受誘導(dǎo)差異最明顯，分別為TDCPP和TCPP的2.42和1.31倍，SOD對TCEP的指示效果最敏感。

直方柱上方a、b和c分別表示在TDCPP、TCPP和TCEP暴露下，處理組與對照組SOD活性差異顯著(P<0.05)。

2.3 3種OFRs-Cl對搖蚊CAT活性的影響

由圖2可知，與對照組相比，TCPP各處理組CAT活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制，TDCPP和TCEP各處理組均表現(xiàn)為隨濃度增大誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng)，且TCEP脅迫下誘導(dǎo)效應(yīng)比TDCPP強(qiáng)。

直方柱上方a、b和c分別表示在TDCPP、TCPP和TCEP暴露下，處理組與對照組CAT活性差異顯著(P<0.05)。

隨著TCPP暴露濃度的增加，各處理組CAT活性變化顯著，均與對照組表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，分別為對照組的2.15、2.61和1.36倍。在不同TDCPP和TCEP暴露濃度下，CAT活性逐漸升高，部分處理組(1.0和5.0 mg·L-1)CAT活性變化顯著，5.0 mg·L-1濃度組變化最為顯著(P<0.05)，分別為對照組的2.28和3.66倍。比較相同濃度TDCPP、TCPP與TCEP發(fā)現(xiàn)，就1.0和5.0 mg·L-1處理組而言，TCEP暴露下的搖蚊幼蟲CAT活性高于其他兩組。與TDCPP和TCEP相比，TCPP暴露下CAT活性最先與對照組之間表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，CAT對TCPP的指示效果最明顯。

2.4 3種OFRs-Cl對搖蚊MDA含量的影響

由圖3可知，各處理組MDA含量表現(xiàn)為低濃度抑制且隨著TCEP濃度的增加，活性逐漸得以恢復(fù)，在最大濃度時與對照組相比無顯著差異。

直方柱上方a、b和c分別表示在TDCPP、TCPP和TCEP暴露下，處理組與對照組MDA含量差異顯著(P<0.05)。

在TDCPP和TCEP暴露下，各處理組MDA含量隨濃度升高逐漸升高，在最高濃度時達(dá)到最大誘導(dǎo)，顯著高于對照組(P<0.05)，分別為對照組的3.30和2.85倍。比較相同濃度TDCPP、TCPP、TCEP發(fā)現(xiàn)，TDCPP暴露下?lián)u蚊幼蟲MDA含量均高于其他兩組，在低濃度0.1 mg·L-1條件下差異最明顯，分別為TCPP和TCEP的2.18和5.55倍。TCEP暴露下MDA最先與對照組表現(xiàn)出顯著差異，MDA對TCEP的指示效果最敏感。TDCPP引起幼蟲體內(nèi)MDA含量增加，呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.5 搖蚊幼蟲目的基因的電泳圖譜

由圖4可知，左側(cè)第一個條帶為marker條帶，從左往右數(shù)第2、3條帶均為HSC70基因，第4、5條帶均為CYP4G基因，第6、7條帶均為GDPAH基因。圖4中可見各引物只有一條條帶，亮度明顯，圖譜清晰，故可做RT-qPCR反應(yīng)的定量分析。

圖4 搖蚊幼蟲目的基因的電泳圖譜

2.6 RT-qPCR參考引物合理性的驗證

熔解曲線共有9個(3個污染物×3個基因/污染物)，選其中兩個作為代表(圖5)。

圖5 目的基因HSC70和CYP4G 的RT-qPCR 的熔解曲線分析

由圖5可知，搖蚊幼蟲暴露于TDCPP后，功能基因HSC70和CYP450的熔解曲線皆為特異的單個峰，沒有出現(xiàn)引物二聚體與非特異性擴(kuò)增，說明引物選擇和RT-qPCR反應(yīng)體系條件的建立適用于供試基因的特異性檢測。

2.7 3種OFRs-Cl對搖蚊HSC70基因表達(dá)的影響

由圖6可知，在TDCPP和TCPP暴露下，各低中濃度處理組HSC70基因表達(dá)水平圍繞對照組上下波動，而高濃度5.0 mg·L-1處理組HSC70基因表達(dá)水平分別上調(diào)和下調(diào)為對照組的2.40倍和45.0%。隨TCEP暴露濃度的增加，各處理組HSC70基因表達(dá)水平呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，分別在1.0和5.0 mg·L-1條件下與對照組相比表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，分別為對照組的73.2%和1.28倍?？梢姡琀SC70基因?qū)CEP的脅迫尤為敏感。比較同濃度TDCPP、TCPP和TCEP發(fā)現(xiàn)，最高濃度5.0 mg·L-1條件下3者的表達(dá)水平差異最顯著，TDCPP暴露下HSC70表達(dá)水平分別為TCPP和TCEP暴露下的5.34和1.87倍。

直方柱上方a、b和c分別表示在TDCPP、TCPP和TCEP暴露下，處理組與對照組HSC70基因表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。

2.8 3種OFRs-Cl對搖蚊CYP4G基因表達(dá)的影響

由圖7可知，在TDCPP和TCPP暴露下，各處理組搖蚊幼蟲體內(nèi)CYP4G基因表達(dá)水平出現(xiàn)明顯波動，均呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，但在最高濃度5.0 mg·L-1條件下仍低于對照組。TCEP暴露下CYP4G基因波動水平較TDCPP和TCPP緩和，僅在最低濃度0.1 mg·L-1條件下與對照相比呈顯著下調(diào)(P<0.05)，為對照組的62.8%。在TDCPP暴露下，顯著下調(diào)的處理組隨濃度增加，CYP4G基因表達(dá)水平依次為對照組的46.1%、14.2%和27.0%。可見CYP4G基因?qū)DCPP的脅迫最為敏感。比較同濃度TDCPP、TCPP與TCEP發(fā)現(xiàn)，在中間濃度1.0 mg·L-1條件下3者表達(dá)水平差異最顯著，TCEP暴露下CYP4G表達(dá)水平為TDCPP和TCPP暴露下的6.02和1.62倍。

直方柱上方a、b和c分別表示在TDCPP、TCPP和TCEP暴露下，處理組與對照組CYP4G基因表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。

3 討論

保幼激素和蛻皮激素的分泌和內(nèi)分泌物質(zhì)的改變是污染物影響昆蟲羽化推遲或提前的內(nèi)在因素[11]。筆者研究中HSC70熱激同源蛋白含量在5.0 mg·L-1TDCPP和TCEP刺激下，均顯著上調(diào)。故推測TDCPP和TCEP可能是誘導(dǎo)HSC70上調(diào)和某種內(nèi)分泌物增加共同導(dǎo)致?lián)u蚊幼蟲羽化的提前，這與文獻(xiàn)[12]研究結(jié)果基本一致。趙小凡[13]和鄭薇薇[14]報道昆蟲細(xì)胞質(zhì)中的HSC70部分入核與USP結(jié)合啟動基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)蛻皮激素增多，進(jìn)而促進(jìn)昆蟲羽化。

SOD和CAT活性顯著提高表明OFRs-Cl脅迫下?lián)u蚊幼蟲體內(nèi)活性氧自由基增多，抗氧化防御系統(tǒng)打開，刺激SOD和CAT的合成來清除過多的氧自由基，從而減少細(xì)胞膜的氧化損傷，這是搖蚊幼蟲對逆境環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)，防御污染物對其細(xì)胞的氧化損傷、脂質(zhì)過氧化等[15]。隨著TDCPP和TCEP濃度的增加，SOD和CAT活性逐漸增加，說明試驗設(shè)計的TDCPP和TCEP濃度在搖蚊幼蟲的耐受限度內(nèi)，不會對搖蚊幼蟲造成嚴(yán)重的氧化脅迫。當(dāng)ρ(TCPP)大于1.0 mg·L-1時，SOD活性增強(qiáng)，CAT活性降低，這說明在>1.0 mg·L-1的TCPP脅迫下，搖蚊幼蟲體內(nèi)SOD活性增強(qiáng)有利于清除過量氧自由基，但其仍有積累，對CAT蛋白產(chǎn)生了破壞和消耗。在低濃度TCEP(0.1 mg·L-1)暴露下，搖蚊幼蟲體內(nèi)MDA含量降低，這可能是由于搖蚊幼蟲機(jī)體的活性氧被抗氧化酶系清除，抑制了脂質(zhì)過氧化作用。高濃度TDCPP和TCPP處理組(5.0 mg·L-1)MDA含量均顯著高于對照組水平，可能是由于在TDCPP和TCPP脅迫下活性氧(ROS)含量增加抑制了抗氧化酶系活性，并且產(chǎn)生過量活性簇引起脂質(zhì)過氧化作用。相同濃度的3種OFRs-Cl暴露下，搖蚊幼蟲體內(nèi)各種酶活性差異較大，可能與污染物本身的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和受試生物的種類等有關(guān)，但筆者發(fā)現(xiàn)指示3種OFRs-Cl最敏感的酶不同。

研究發(fā)現(xiàn)Gr2+、Cu2+、Zn2+、敵百蟲等環(huán)境污染物會誘導(dǎo)HSP70家族的表達(dá)[16-17]。HSC70是熱休克蛋白70(HSP70)家族的重要成員，受誘導(dǎo)后表達(dá)量變化顯著，在生命活動中有重要作用。5.0 mg·L-1的TDCPP和TCEP誘導(dǎo)搖蚊幼蟲體內(nèi)HSC70的顯著表達(dá)，而且還表現(xiàn)出明顯的組織特異性，如促進(jìn)幼蟲羽化。中低濃度TDCPP和TCPP脅迫下，HSC70與對照組相比差異不顯著，可能是因為在中低濃度污染物刺激下，搖蚊幼蟲體內(nèi)大量解毒酶發(fā)揮作用，快速降低了污染物毒性作用。VALERIA等[18]研究發(fā)現(xiàn)伸展搖蚊在安定藥中暴露3 h后，其體內(nèi)HSC70被誘導(dǎo)表達(dá)，PLANELL等[19]研究報道相較于重金屬Cd、Gr、Ni、Cu濃度較低的河流，濃度較高的河流中伸展搖蚊體內(nèi)HSC70的表達(dá)是受抑制的，這可能與污染物種類或其本身的毒性相關(guān)。CYP450是生物體內(nèi)的一類解毒酶，其中，GYP4家族成員與生物的抗毒害性相關(guān)。筆者發(fā)現(xiàn)在3種OFRs-Cl脅迫下，搖蚊幼蟲體內(nèi)GYP4G隨濃度增加均下調(diào)，可能是因為CYP450是個大家族，CYP4G被抑制，家族中其他CYP亞型基因表達(dá)上調(diào)發(fā)揮了作用，亦表明3種OFRs-Cl抑制搖蚊幼蟲體內(nèi)CYP4G的表達(dá)。有研究表明在銅污染中暴露3 h，隨其濃度的增加，伸展搖蚊CYP4G表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下調(diào)趨勢[20]，相似的變化趨勢在伸展搖蚊暴露于鄰苯二甲酸二(2-乙基已酯)(EHDP)24 h時亦出現(xiàn)[21]。相同濃度TDCPP、TCPP和TCEP脅迫下，搖蚊幼蟲HSC70表達(dá)水平在5.0 mg·L-1條件下差異最明顯，可能與搖蚊幼蟲羽化現(xiàn)象的提前相關(guān)；在5.0 mg·L-1時，TCPP和TCEP脅迫下?lián)u蚊幼蟲CYP4G表達(dá)水平高于TDCPP。另有研究表明，TCPP顯著提高了雞的CYP450家族CYP3A37亞型基因的表達(dá)水平，而TDCPP誘導(dǎo)了CYP2H1亞型基因的表達(dá)水平[22]，這可能是CYP450家族中各種亞型基因相互作用造成的。筆者發(fā)現(xiàn)解毒酶如SOD、CAT活性與解毒基因亞型CYP4G的變化趨勢不一致，類似結(jié)果在文獻(xiàn)[23]中亦有報道，這可能與基因轉(zhuǎn)錄后修飾以及基因和蛋白的降解速率等不同，導(dǎo)致基因與其對應(yīng)的蛋白無相關(guān)性有關(guān)。

4 結(jié)論

(1)5.0 mg·L-1TDCPP和TCEP促進(jìn)幼蟲的羽化，且TDCPP促進(jìn)效果更強(qiáng)，這可能是由于TDCPP和TCEP誘導(dǎo)了保幼激素和內(nèi)分泌激素的增加，TDCPP誘導(dǎo)效果更強(qiáng)。

(2)SOD、CAT活性和MDA含量對TDCPP、TCPP和TCEP的毒性響應(yīng)各不相同。SOD和MDA對TCEP的指示效果最敏感，CAT對TCPP的指示效果最敏感。

(3)HSC70在最高濃度TDCPP和TCEP脅迫下顯著上調(diào)，推測與昆蟲的羽化相關(guān)。CYP4G在3種OFRs-Cl脅迫下均表現(xiàn)出下調(diào)趨勢。HSC70和CYP4G基因分別對TDCPP和TCEP的脅迫尤為敏感。

(4)筆者試驗僅為24 h的急性毒性試驗，未關(guān)注更長時間的3種OFRs-Cl對搖蚊幼蟲的時間-響應(yīng)關(guān)系，羽化現(xiàn)象與HSC70表達(dá)水平相關(guān)的機(jī)理探討也有待深入。