石少敏,趙建軍*,楊 蕾

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.呼吸內(nèi)科;2.鏡檢科,吉林 長春130033)

無論從發(fā)病率和死亡率調(diào)查顯示，肺癌都是世界上最常見的惡性腫瘤，肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的最主要原因[1,2]。在肺癌的分類中，非小細胞肺癌(NSCLC)在所有肺癌病例中大約占80%[3]。早期診斷的NSCLC手術(shù)切除后的生存率較高[4]。然而，當病人處于中期或者晚期再進行治療，特別是有明顯轉(zhuǎn)移的患者，其平均生存率一般不超過18個月[5]。因此，如何尋找有效的分子治療的靶點成為提高患者生存率的關(guān)鍵。

研究顯示，腫瘤細胞與正常細胞的代謝方式不同，其往往通過有氧糖酵解的方式獲得能量，即使在氧氣充足的情況下[6]。研究顯示，腫瘤這種特殊的代謝方式在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，成為研究的熱點[7-9]。本課題擬通過體外實驗明確，腫瘤細胞有氧糖酵解在蛋白酶體誘導(dǎo)的非小細胞肺癌中的作用，為臨床靶向腫瘤有氧糖酵解和蛋白酶體途徑聯(lián)合用藥提供一定的策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人非小細胞肺腺癌H157細胞購買于中國科學(xué)院細胞庫，胎牛血清，1640培養(yǎng)液，胰酶購買自美國Hyclone 公司。糖酵解抑制劑2-DG，bortezomib、MTT(四甲基偶氮唑藍)購買自美國Sigma公司，cleaved caspase-3，cleaved PARP，cytochrome C抗體購買自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)，傳代

體外培養(yǎng)H157細胞，給予含有10%血清的1640培養(yǎng)液，放入CO2濃度調(diào)整為5%，溫度為37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，觀察細胞貼壁情況，待細胞完全貼壁后生長至培養(yǎng)皿的80%進行細胞傳代，利用胰酶消化細胞后按照1∶2的比例進行傳代，按照實驗分組進行相應(yīng)的給藥，作用時間結(jié)束后進行相應(yīng)的檢測。

1.3 細胞存活率檢測

為評價藥物對細胞存活率的影響，利用MTT試劑對存活率進行檢測。當細胞處于對數(shù)生長期時進行胰酶消化，進行96孔板鋪板，每孔約5000個細胞，每組設(shè)置6個重復(fù)孔，鋪板待細胞完全貼壁后，給予相應(yīng)的藥物刺激，藥物作用完成后，96孔每孔內(nèi)加入12 μl MTT試劑(5 mg/mL)，搖勻后放入孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，3-5 h結(jié)束，MTT作用完成后，棄除孔內(nèi)的液體，加入130 μl的DMSO，震蕩混勻，利用酶標儀檢測OD值(吸光度值，490 nm)。

1.4 Western Blotting(免疫印跡)檢測細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白水平各組細胞蛋白質(zhì)表達

當細胞發(fā)生凋亡時，細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白的表達水平會發(fā)生明顯的改變，我們利用Western Blotting檢測不同作用條件下H157細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達水平，具體步驟如下：藥物作用完成后，提取細胞總蛋白，首先棄除細胞培養(yǎng)液，利用PBS培養(yǎng)液清洗細胞3次后，加入200 μl RIPA裂解液，作用5 min后利用細胞刮將H157細胞完全刮除，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，低度混勻作用45 min，離心，4 000 rpm/min離心20 min，棄除沉淀，取上清后對蛋白濃度進行定量(BCA方法)。定量后，加入loading buffer，95℃變性10 min，按照總蛋白濃度一致的方案進行蛋白上樣，丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至煮PVDF膜上，完成后利用5%脫脂奶粉中封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，低溫孵育過夜，第2天利用PBST清洗3遍后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h后利用PBST清洗3次,ECL發(fā)光顯示，對結(jié)果進行拍照分析。

1.5 流式細胞儀檢測H157細胞凋亡率

細胞凋亡率的改變是細胞發(fā)生凋亡準確的檢測指標，我們利用流式細胞術(shù)進行凋亡率的檢測，具體步驟如下：藥物作用完成后，收集細胞，利用PBS(預(yù)冷)清洗細胞中殘留的培養(yǎng)液后，利用凋亡檢測試劑盒分別加入取Annexin V-FITC和PI溶液，避光作用半個小時，利用流式細胞術(shù)進行熒光強度的檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

流式細胞術(shù)和western blotting結(jié)果利用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，兩組比較采用t檢驗的方法，3組及3組以上采用方差分析的方法，P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bortezomib對人非小細胞肺腺癌H157細胞存活率的影響

為首先明確bortezomib 對H157細胞存活率的影響，我們利用MTT方法檢測了細胞存活率的改變。待細胞生長至對數(shù)期后傳代分組，共分為4組：對照組，bortezomib 25 nm組，bortezomib 50 nm組，bortezomib 100 nm組，觀察不同濃度bortezomib 對H157細胞存活率的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比較，不同濃度的bortezomib均可以引起細胞存活率的下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，通過比較不同濃度之間的吸光度值發(fā)現(xiàn)，bortezomib 對H157細胞增殖率的抑制具有明顯的劑量依賴性，見表1。

表1 Bortezomib對人非小細胞肺腺癌H157細胞生存率的影響

*與Control相比較有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05

2.2 Bortezomib引起凋亡相關(guān)蛋白表達水平的改變

上述結(jié)果呈現(xiàn)出，Bortezomib可以引起細胞存活率的下降，我們下一步需要明確凋亡是否參與了這個過程，我們利用western blotting的方法檢測了3種凋亡相關(guān)蛋白的表達水平cleaved caspase-3、cleaved PARP、cytochrome C。結(jié)果顯示出，不同濃度的Bortezomib可以明顯的增加3種凋亡相關(guān)蛋白分子的表達，見圖1。

2.3 Bortezomib引起H157細胞凋亡率的增加

為進一步明確凋亡的發(fā)生，我們利用流式細胞術(shù)進一步檢測了H157細胞內(nèi)凋亡率的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的Bortezomib可以明顯的增加H157細胞的凋亡率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

圖1 Bortezomib對凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

實驗分組凋亡率(%)對照組3.80±1.124硼替佐米25 nM7.86±0.156*硼替佐米50 nM12.53±0.071*硼替佐米100 nM21.58±2.352*

*與Control相比較有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05

2.4 糖酵解抑制劑2-DG對Bortezomib引起的細胞存活率下降的影響

研究顯示，腫瘤細胞特殊的代謝方式有氧糖酵解在抗腫瘤藥物中發(fā)揮了重要的作用，因此我們下一步利用糖酵解抑制劑檢測其在Bortezomib誘導(dǎo)的細胞存活率下降中的作用。分為4組：對照組，2-DG組(5 mM)，Bortezomib組(50 nM)，Bortezomib+2-DG組。利用MTT方法檢測細胞存活率的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨Bortezomib相比較，聯(lián)合應(yīng)用2-DG可以進一步增加Bortezomib引起的細胞存活率的下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 2-DG對Bortezomib引起H157細胞生存率下降的影響

*與Control組比較，P<0.05；#與Bortezomib組，P<0.05

2.5 糖酵解抑制劑2-DG對Bortezomib引起的細胞凋亡率上升的影響

前面結(jié)果顯示，聯(lián)合2-DG可以進一步增加Bortezomib引起的細胞存活率的下降，我們利用流式細胞術(shù)進一步明確聯(lián)合應(yīng)用對細胞凋亡率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合2-DG可以進一步增加Bortezomib引起的細胞凋亡率的增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4 2-DG對Bortezomib引起H157細胞凋亡率上升的影響

*與Control組比較，P<0.05；#與Bortezomib組，P<0.05

2.6 糖酵解抑制劑2-DG對Bortezomib引起的細胞相關(guān)蛋白表達水平的影響

在檢測凋亡率的基礎(chǔ)上，我們利用western blotting進一步檢測了凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP表達水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用可以進一步增加Bortezomib引起的凋亡相關(guān)蛋白的表達，見圖2。

圖2 2-DG對Bortezomib引起的細胞相關(guān)蛋白表達水平的影響

3 討論

泛素蛋白酶體介導(dǎo)了細胞內(nèi)絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)降解過程，其通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解參與細胞內(nèi)很多生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，包括細胞周期，分化，死亡[10]。近來的研究表明，泛素蛋白酶體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了及其重要的作用，其通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖相關(guān)蛋白，凋亡相關(guān)蛋白，血管生成相關(guān)蛋白以及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的降解，參與癌癥的調(diào)控[11]。因此，圍繞泛素蛋白酶體途徑研發(fā)了相關(guān)的抑制劑，其中Bortezomib研發(fā)的最早，也是研究最為廣泛的蛋白酶體抑制劑，能抑制26S蛋白酶體亞基的活性[12]。

為明確泛素蛋白酶體系統(tǒng)在非小細胞肺腺癌中的作用，我們利用Bortezomib和體外培養(yǎng)H157細胞檢測了細胞存活率和凋亡的改變，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同弄得的Bortezomib均可以引起細胞存活率的下降和凋亡率的上升，提示Bortezomib可以用來治療非小細胞肺腺癌。大量的臨床研究結(jié)果顯示，長期使用一種化療藥物會引起腫瘤的耐藥性的產(chǎn)生，如何克服這種耐藥性，尋找新的聯(lián)合治療策略成為研究的熱點和關(guān)鍵。

長期處于低氧和低營養(yǎng)的調(diào)節(jié)下，使得腫瘤細胞的代謝方式發(fā)生了改變，腫瘤細胞往往通過糖酵解的方式獲得能量，即使在氧氣充足的調(diào)節(jié)下，腫瘤細胞這種特殊的代謝為腫瘤細胞高的增殖速率提供支持。研究顯示，靶向有氧糖酵解可以有效的增加抗腫瘤藥物引起的細胞死亡[13]。有氧糖酵解是否參與了Bortezomib誘導(dǎo)的非小細胞肺腺癌細胞死亡還不是很清楚，因此我們利用糖酵解抑制劑2-DG對這個問題進行了探討。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨使用Bortezomib相比較，聯(lián)合糖酵解抑制可以進一步增加細胞存活率的下降和凋亡率的上升。

綜上所述，蛋白酶體抑制劑Bortezomib可以誘導(dǎo)非小細胞肺腺癌細胞死亡，聯(lián)合糖酵解抑制劑可以增加細胞死亡和凋亡的發(fā)生，研究結(jié)果為臨床尋找新的治療非小細胞肺腺癌的策略提供依據(jù)。