孫墨可 李曉薇 張曼 田娟 董玉迪

摘 要：比較2種DNA提取方法提取靈芝菌絲體基因組DNA之間的差異，分別用改良的CTAB法和TPS法提取10株菌絲體基因組DNA，用超微量紫外分光光度計測定和瓊脂糖凝膠電泳的方法進行濃度及純度的測定。結(jié)果表明：利用改良的CTAB法提取靈芝菌絲體基因組DNA得到的濃度與純度較高，但耗費時間較長；利用TPS法提取的靈芝菌絲體基因組濃度與純度相對較低，但相對耗費時間較短；這2種方法提取的基因組都可以用于后續(xù)的PCR擴增反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：靈芝；CTAB；TPS；基因組

中圖分類號 S567.31 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）21-0034-02

靈芝（Ganoderma lingzhi）是我國著名的食藥用真菌，有著悠久的歷史文化[1]。靈芝含有多糖、萜類化合物、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等多種活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝具有保肝、抗腫瘤、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫及延緩衰老的作用[2-6]。當前對靈芝分子生物學研究不斷深入，如靈芝中的基因克隆與表達，轉(zhuǎn)化體系的建立等[7-9]。靈芝基因組的提取是進行后續(xù)分子生物學研究的基礎(chǔ)，基因組DNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)實驗的質(zhì)量，實驗過程耗時少也是許多研究者的追求。CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性[10]。TPS法是一種快速提取小量DNA的方法，最初用到水稻上。筆者利用CTAB法與TPS法分別提取靈芝基因組DNA以進行比較，旨在為今后靈芝分子生物學方面的科研提供較適宜的DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 菌株 靈芝（G.lingzhi）由吉林農(nóng)業(yè)大學菌物研究所提供。取生長在PDA培養(yǎng)基上的7～10d的靈芝菌絲10株，進行靈芝基因組DNA的提取。

1.2 試劑與儀器 試劑：Tris-HCl，EDTA，KCl，氯仿，異戊醇，異丙醇，乙醇等。儀器：人工氣候培養(yǎng)箱（日本日立），電泳儀（JUNYI），離心機，凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP），超微量紫外可見分光光度計（Thermo），電子天平（Denver）等。

1.3 方法

1.3.1 CTAB法提取靈芝基因組 CTAB法提取基因組步驟如下：1）將靈芝菌絲加液氮研磨成粉末狀；2）加入700μL的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65℃水浴預(yù)熱），每5min輕輕震蕩幾次，20min后放入離心機中12000r/min，離心15min；3）小心吸取上清液，加入等體積的酚：氯仿（各400μL）溶液，混勻，4℃，12000r/min，離心10min；4）小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4℃，12000r/min，離心10min；5）重復(fù)步驟（4）1～2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止；6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，離心10min；7）棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；8）室溫下超凈臺干燥后，溶于50uLddH2O溶解DNA，于-20℃保存。用超微量紫外分光光度計測定和瓊脂糖凝膠電泳的方法進行濃度及純度的測定。

1.3.2 TPS法提取靈芝基因組 TPS法提取靈芝基因組步驟如下：1）將靈芝菌絲加液氮研磨成粉末狀加入65℃預(yù)熱的TPS DNA提取液700uL，充分混勻；2）65℃水浴30min，期間顛倒混勻3～4次；3）加入氯仿/異戊醇/乙醇（體積比為20∶1∶4），混合搖勻，4℃，12000r/min，離心10min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中；4）加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置10min，4℃，12000r/min，離心10min，棄上清；5）加70%乙醇500uL洗滌沉淀，4℃，12000r/min，低速離心5min，棄上清，超凈臺吹干沉淀，加入50uLddH2O溶解DNA；6）置于-20℃保存。用超微量紫外分光光度計測定和瓊脂糖凝膠電泳的方法進行濃度及純度的測定。

1.3.3 紫外分光光度計檢測DNA 取DNA樣品1μL，用超微量紫外可見分光光度計測定DNA樣本在260nm和280nm的吸光度A，DNA純度以A260/A280的值確定，同時測定提取DNA的濃度。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 配制1%的瓊脂糖凝膠，取2μL DNA樣品，120V電泳25min，凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果，對提取DNA進行完整性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度及純度 利用CTAB法和TPS提取出的靈芝基因組DNA分別用超微量紫外分光光度計測定（見表1），2種方法提取的DNA吸光度比值都符合標準。CTAB法提取的DNA濃度平均值為197.81μg/mL，TPS法提取的DNA濃度值平均為44.78μg/mL。CTAB法提取的DNA比TPS法提取的DNA濃度要高。

2.2 DNA完整性的測定 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，檢測結(jié)果見圖1，用凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果并成像，對提取DNA進行完整性檢測。CTAB法DNA量較多，條帶清晰。TPS法提取的DNA量相對較少，但完整性很好，沒有降解。

3 結(jié)論

DNA的提取是進行分子生物學研究的基礎(chǔ)[11]。在靈芝分子生物學實驗中，DNA提取大多數(shù)使用的是CTAB法。該方法程序復(fù)雜，從取樣到提取出基因組DNA，需要6～8h，但提取出的DNA質(zhì)量較高。TPS法是一種快速提取小量DNA的方法，最初用在水稻上。與CTAB法相比，TPS法簡化了操作步驟，節(jié)省了時間，但提取出的DNA質(zhì)量相對較低，適合小量檢測應(yīng)用。2種方法各有利弊，可根據(jù)具體的條件選擇合適的方法。近年來，許多學者也相繼開展了靈芝的分子生物學研究工作，因此提高靈芝基因組DNA提取方法，對于提高靈芝后續(xù)的分子生物學研究有重要的意義。

參考文獻

[1]卯曉嵐.中國經(jīng)濟真菌[M].北京：科學出版社，1998.

[2]Liu Y W，Gao J L，Guan J，et al.Evaluation of antiproliferative activities and action mechanisms of extracts from two species of Ganoderma on tumor cell lines[J].J Agric Food Chem，2009，57（8）：3087-3093.

[3]Stanley G，Harvey K，Slivova V，et al.Ganoderma lucidum，suppresses angiogenesis through the inhibition of secretion of VEGF and TGF-β1 from prostate cancer cells[J].Biochemical & Biophysical Research Communications，2005，330（1）：46-52.

[4]Sliva D.Ganoderma lucidum in cancer research[J].Leukemia Research，2006，30（7）：767-768.

[5]Mulle C I，Kumagai T，O'Kelly J，et al.Ganoderma lucidum causes apoptosis in leukemia，lymphoma and multiple myeloma cells[J].Leuk Res，2006，30（7）：841-848.

[6]Shieh Y H，Liu C F，Huang Y K，et al.Evaluation of the hepatic and renal-protective effects of Ganoderma lucidum in mice[J].Am J Chin Med，2001，29（03n04）：0100052-.

[7]孫墨可，張曼，田娟，等.真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因LZ-8過表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體的研究[J].菌物學報，2017（12）：1625-1631.

[8]孫墨可，陳歡，李晰亮，等.赤芝原生質(zhì)體分離與再生研究[J].菌物研究，2015，13（1）：52-54.

[9]孫墨可.靈芝轉(zhuǎn)化體系的建立與調(diào)節(jié)免疫蛋白的超表達[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2014.

[10]胡根海，喻樹迅.利用改良的CTAB法提取棉花葉片總RNA[J].棉花學報，2007，19（1）：69-70.

[11]裴杰萍，端青.DNA提取方法的研究進展[J].微生物學免疫學進展，2004，32（3）：76-78.

（責編：徐世紅）