胡靄臻，俞艷，周超，王小航，鄭善堅(jiān)

(浙江師范大學(xué)野生動(dòng)物保護(hù)與利用技術(shù)中心 野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004)

棘胸蛙(Quasipaaspinose)，又稱石蛙或石雞，屬于兩棲綱、無(wú)尾目、蛙科，是我國(guó)獨(dú)有的野生大型蛙類[1]。棘胸蛙肉質(zhì)細(xì)膩香滑，富含18種氨基酸，食用價(jià)值和藥用價(jià)值高，被譽(yù)為“百蛙之王”[2-13]。隨著野生棘胸蛙的過(guò)度捕撈和生存環(huán)境急劇惡化，野生棘胸蛙數(shù)量明顯下降，2012年被列入“世界自然保護(hù)聯(lián)盟”(IUCN)瀕危物種紅色名錄，屬易危物種。本研究通過(guò)對(duì)患病蛙和健康蛙的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以期為棘胸蛙檸檬酸桿菌的分離鑒定及防治提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蛙

患病棘胸蛙采自金華某棘胸蛙養(yǎng)殖基地，平均體重(120±8.5)g；健康棘胸蛙均購(gòu)自金華李駿棘胸蛙養(yǎng)殖基地，平均體重(50±4.3)g。

1.1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Taq酶、PCR Master Mix和DL 2000 DNA Marker均購(gòu)自克勞寧(北京)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取患病棘胸蛙的頭部、腿部和肝組織，接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)24 h，觀察病原菌的生長(zhǎng)情況及菌落特征。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的單一菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，分別命名為L(zhǎng)J10201、LJ10202、LJ10203。革蘭氏染色觀察病原菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和特征。

1.2.2 人工感染試驗(yàn)

取純化后的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后5 000 r·min-1離心1 min，用無(wú)菌PBS離心洗滌2次，調(diào)整菌懸液濃度至1×107mL-1。取健康棘胸蛙48只，隨機(jī)分成4組，每組12只。采用腹腔注射法，分別注射0.1 mL LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株的菌懸液，對(duì)照組腹腔注射0.1 mL無(wú)菌PBS。定期換水，保持水質(zhì)清新，于實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)10 d，每天觀察并記錄組棘胸蛙的患病與死亡情況。

1.2.3 生理生化特性鑒定

使用梅里埃VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定生理生化指標(biāo)。

1.2.4 16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

用DNA提取試劑盒分別提取純培養(yǎng)的LJ10201、LJ10202、LJ10203病原菌DNA。上游引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 下游引物為5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。25 μL PCR反應(yīng)體系為ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，10×buffer、dNTP及Taq酶混合溶液12.5 μL。采用的PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 1 min，49～54 ℃(12個(gè)溫度梯度)1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，所得產(chǎn)物電泳后觀察。PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)分離得到的3株病原菌16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

1.2.5 藥敏特性分析

病原菌于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種在LB液體培養(yǎng)基上，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法和McFarland比濁法調(diào)整菌懸液濃度至1×107mL-1。用無(wú)菌移液管量取100 μL菌懸液于普通瓊脂培養(yǎng)基，涂布均勻。采用標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)，觀察并記錄各組抑菌圈的大小，根據(jù)抑菌圈大小判斷其藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌觀察

從患病棘胸蛙頭部、腿部和肝部分離得到的病原菌LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株在普通瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)均為：乳白色，不透明或半透明，凸起，邊緣光滑整齊，恒溫培養(yǎng)24 h后菌落直徑為1.0～3.0 mm。挑取單菌落，革蘭氏染色，置于普通光學(xué)顯微鏡下鏡檢，發(fā)現(xiàn)3株病原菌均為革蘭氏陰性菌，呈桿狀或短桿狀，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。

2.2 人工感染實(shí)驗(yàn)

用分離得到的病原菌感染健康的棘胸蛙72 h后，棘胸蛙出現(xiàn)發(fā)病癥狀，癥狀表現(xiàn)為：頭部出現(xiàn)白斑，從吻部開(kāi)始表皮潰爛至向全身蔓延并逐漸脫落，肌肉露出，攝食活動(dòng)減弱，腹部腫大，運(yùn)動(dòng)減弱，個(gè)體表現(xiàn)呆滯。感染96 h后，棘胸蛙出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。感染8 d后，3個(gè)試驗(yàn)組的棘胸蛙全部死亡，對(duì)照組生長(zhǎng)狀況良好。解剖病死蛙發(fā)現(xiàn)，其腹部有不同程度的積水，內(nèi)臟呈點(diǎn)狀出血，胃及腸道內(nèi)無(wú)食物或少有食物，并伴有腸道輕度糜爛等癥狀，與原發(fā)病棘胸蛙表現(xiàn)癥狀相同且病理變化相似。在病死蛙的肝、腎等處分離得到與LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株菌落形態(tài)相似、生理生化特征一致的菌株，說(shuō)明本試驗(yàn)中分離得到的3株LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株為致病菌株。

2.3 生理生化特征鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，運(yùn)用微生物全自動(dòng)分析儀對(duì)3株病原菌進(jìn)行生理生化檢測(cè)菌株檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，LJ10201、LJ10203菌株各項(xiàng)生理生化檢測(cè)結(jié)果與弗氏檸檬酸桿菌相符合，初步判定其為弗氏檸檬酸桿菌；LJ10202菌株各項(xiàng)生理生化指標(biāo)與布氏檸檬酸桿菌相符合，初步將其判定為布氏檸檬酸桿菌。

表1 菌株生理生化特征

注：+，陽(yáng)性；-，表示陰性；(-)，弱陰性。

2.4 16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

分別以LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株DNA為模板進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度約為1 500 bp(圖1)。送檢測(cè)序后，與Gene bank中的序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)LJ10201和LJ10203菌株的16S rDNA基因序列與弗氏檸檬酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(KF535108.1、KF145194.1)的同源性高達(dá)99%， LJ10202菌株的16S rDNA基因序列與布氏檸檬酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(KC139411.1)的同源性高達(dá)99%。

圖1 LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株 16S rDNA電泳結(jié)果

選取弗氏檸檬酸桿菌、布氏檸檬酸桿菌和腸桿菌科不同屬的菌種部分16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。

2.5 藥敏特性

研究發(fā)現(xiàn)，從患病棘胸蛙頭部分離得到的LJ10201菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、新霉素、頭孢他啶、氯霉素、頭孢拉定(先鋒Ⅵ)、鏈霉素、恩諾沙星、阿莫西林、慶大霉素敏感，對(duì)阿奇霉素、羅紅霉素中度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、紅霉素、克拉霉素、萬(wàn)古霉素、利福平、青霉素、卡那霉素不敏感。從病蛙腿部分離得到的LJ10202菌株對(duì)頭孢拉定(先鋒Ⅵ)、氯霉素敏感，對(duì)新霉素、克拉霉素、萬(wàn)古霉素、羅紅霉素中度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、紅霉素、阿莫西林、阿奇霉素、強(qiáng)力霉素、利福平、青霉素、頭孢他啶、鏈霉素、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素不敏感。從病蛙肝部分離得到的LJ10203菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、頭孢他啶、阿奇霉素、鏈霉素、恩諾沙星、新霉素、卡那霉素、慶大霉素敏感，對(duì)克拉霉素中度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、紅霉素、頭孢拉定(先鋒Ⅵ)、阿莫西林、萬(wàn)古霉素、利福平、青霉素、羅紅霉素、氯霉素不敏感(表2)。

圖2 LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表2 LJ10201、LJ10202、LJ10203菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S，敏感；I，中度敏感；R，不敏感。

本實(shí)驗(yàn)中，各菌株的藥物敏感性與已報(bào)道的弗氏檸檬酸桿菌的耐藥性有一定差異，各菌株之間的藥物敏感性也存在差異，這可能與分離方法或菌株來(lái)源不同有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸桿菌對(duì)紅霉素、青霉素、利福平等常用藥物已產(chǎn)生耐藥性，但由于個(gè)體生活環(huán)境等的差異，不同來(lái)源的菌株之間耐藥性仍有差異。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，要針對(duì)病原菌合理用藥，外用兼內(nèi)服抗生素藥物，結(jié)合多維補(bǔ)充，提高機(jī)體免疫力，加快創(chuàng)口愈合，才能達(dá)到良好的治療效果，并減緩檸檬酸桿菌耐藥性的形成。

3 討論

通過(guò)無(wú)菌操作分離得到棘胸蛙爛皮病的病原菌，經(jīng)細(xì)菌形態(tài)、生理生化鑒定、16S rDNA基因序列同源性分析和人工感染試驗(yàn)，證實(shí)病原菌LJ10201、LJ10203為弗氏檸檬酸桿菌， LJ10202為布氏檸檬酸桿菌。弗氏檸檬酸桿菌和布氏檸檬酸桿菌廣泛分布于土壤、水體和動(dòng)物體內(nèi)，可引起人獸共患疾病。EWERS等[14]發(fā)現(xiàn)狗、貓和馬可感染弗氏檸檬酸桿菌，引起炎癥、敗血癥甚至急性死亡，劉廣義等[15]從患者體內(nèi)分離得到了156株弗氏檸檬酸桿菌，YANAGAWA等[16]、MINJEONG等[17]分別從臨床感染的患者體內(nèi)分離得到病原菌檸檬酸桿菌。

近年來(lái)，有關(guān)檸檬酸桿菌感染水生動(dòng)物的報(bào)道日漸增多。王家禎等[8]發(fā)現(xiàn)青魚(yú)感染弗氏檸檬酸桿菌后出現(xiàn)體表發(fā)黑、粘液增多、肛門(mén)紅腫、腹部有出血點(diǎn)等癥狀，解剖發(fā)現(xiàn)其腹腔積水，肝、脾腫大，腸道發(fā)炎并出血，從病魚(yú)肝臟中可分離得到弗氏檸檬酸桿菌。肖寧等[18]從瀕死的克氏原螯蝦肝胰腺中分離得到弗氏檸檬酸桿菌，曹正嬌[12]和高正勇等[19]從患病的大鯢中分離得到了弗氏檸檬酸桿菌。水生動(dòng)物易感染檸檬酸桿菌可能與水生動(dòng)物生存環(huán)境有關(guān)，水體中的檸檬酸桿菌可由水生動(dòng)物傷口或經(jīng)口攝食而大量進(jìn)入體內(nèi)，引發(fā)疾病，且在水中細(xì)菌性疾病蔓延速度極快，往往引起個(gè)體大量死亡[20]。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，養(yǎng)殖人員要做好預(yù)防措施，尤其在大雨過(guò)后，要注意監(jiān)測(cè)水質(zhì)，保持水質(zhì)清新，嚴(yán)防因雨水沖刷而大量進(jìn)入水體中的檸檬酸桿菌感染水產(chǎn)動(dòng)物，引發(fā)大面積死亡。

本研究中，以濃度1×108mL-1病原菌感染健康棘胸蛙，9 d后棘胸蛙死亡率達(dá)到100%，可見(jiàn)檸檬酸桿菌對(duì)棘胸蛙有較高的致病性。已有研究表明，檸檬酸桿菌的致病性與其脂多糖結(jié)構(gòu)、致病基因和耐藥基因有較大關(guān)系。嚴(yán)玉霖等[21]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素為脂多糖中的主要毒力成分，可在細(xì)菌溶解或活躍繁殖時(shí)釋放，并引起宿主免疫應(yīng)答，危害人畜健康。周加利[22]發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌脂多糖中的O抗原種類對(duì)人和動(dòng)物有很強(qiáng)的感染力，并且對(duì)內(nèi)毒素的毒力作用有調(diào)控能力。白莉[23]在研究中發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌可能帶有編碼OmpX-sfaABC-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等毒力島，對(duì)其致病性有極大影響。閻斌倫等[24-28]研究表明，弗氏檸檬酸桿菌引起腹瀉的主要原因可能是攜帶有定居因子抗原cfa基因。但細(xì)菌的致病基因與其致病性之間的作用機(jī)制仍然不清楚，確定致病基因的作用機(jī)理將是今后研究的熱點(diǎn)。

目前對(duì)棘胸蛙檸檬酸桿菌的防治方法主要停留在預(yù)防為主的階段，如有感染即選用常用抗生素進(jìn)行治療，但已有研究表明檸檬酸桿菌已對(duì)某些藥物產(chǎn)生耐藥性[29-32]，且另有研究表明其毒力有加強(qiáng)的趨勢(shì)[33-34]。長(zhǎng)此以往，傳統(tǒng)藥物的治療未必能達(dá)到較好的療效。因此，今后應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌黏附、胞外酶產(chǎn)物、致病基因和耐藥基因的研究，尤其是對(duì)強(qiáng)毒力菌株的研究，如致病基因與致病性之間的關(guān)系、耐藥基因的作用機(jī)理等，以期研發(fā)能夠針對(duì)性地遏制病原菌黏附，阻斷致病基因或耐藥基因傳遞、表達(dá)的抗細(xì)菌毒力的新型藥物。