胡菡 李建科│文

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093

前言

蜂王漿是蜜蜂哺育蜂咽下腺和上顎腺的分泌物，用來(lái)哺育蜂王和1～3日齡蜜蜂幼蟲的白色或淡黃色乳狀液體[1-5]。蜂王漿是天然功能性蜂產(chǎn)品，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及護(hù)膚美容等多方面生理作用[6-14]。中國(guó)是世界蜂王漿第一生產(chǎn)國(guó)，年產(chǎn)約4000噸，也是第一出口國(guó)，世界上90%以上的蜂王漿來(lái)自于中國(guó)[15-17]。

蜂王漿成分復(fù)雜，營(yíng)養(yǎng)豐富，水分含量為60.0%～70.0%，蛋白質(zhì)含量為12.0%～15.0%，脂類物質(zhì)為3.0%～6.0%，碳水化合物為10.0%～16.0%，小分子物質(zhì)（如維生素、礦物質(zhì)、游離氨基酸）為2%～3%[1,15，18-23]。蛋白質(zhì)是蜂王漿中含量最豐富的有機(jī)成分，約占干物質(zhì)的30%～50%[15；24-26]。而王漿主蛋白家族（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）占蜂王漿可溶性蛋白質(zhì)含量的80%以上[22,27]。其中，MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4和MRJP5約占MRJPs總量的82%～90%[28]，它們是、蜂王漿生物學(xué)功能的主要體現(xiàn)者，因此，隨著對(duì)蜂王漿成分和功能認(rèn)識(shí)的不斷深入，對(duì)MRJPs研究正在不斷深化。

蜂王漿的品質(zhì)與新鮮度之間存在密切的關(guān)系。在蜜蜂進(jìn)化過程中，為了給蜂王提供最高效的食物，哺育蜂是以交喙的方式分泌蜂王漿飼喂給蜂王。哺育蜂也只是在幼蟲需要進(jìn)食時(shí)才分泌蜂王漿飼喂它們。哺育蜂一天會(huì)訪問一個(gè)幼蟲大約1,300次，在整個(gè)幼蟲的發(fā)育期的訪問次數(shù)會(huì)超過10,000次，特別是封蓋前一天訪問近3,000次[29]。這種進(jìn)化方式最大程度的保證了蜂王漿的新鮮度，從而提供最高效的營(yíng)養(yǎng)。然而蜜蜂的進(jìn)化特征造就了蜂王漿是一種極其不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物，對(duì)儲(chǔ)藏條件要求較高，各種因素包括溫度、時(shí)間、空氣、水蒸氣和光都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響[30]。日本研究表明，在室溫下儲(chǔ)藏1周，蜂王漿中蛋白質(zhì)就有明顯降解，儲(chǔ)藏1個(gè)月會(huì)就發(fā)生質(zhì)變[30]。隨儲(chǔ)藏時(shí)間的增長(zhǎng)，蜂王漿顏色加深，黏度增大，產(chǎn)生氣泡；水溶性蛋白和單糖含量降低，可滴定酸增加，維生素C含量降低，SOD酶活力下降，抑菌性下降[31-33]。因此，蜂王漿的儲(chǔ)藏和保鮮一般在隔氧避光條件下進(jìn)行低溫冷凍包藏。若儲(chǔ)藏不當(dāng)，其各種性狀（物理或化學(xué)）及其品質(zhì)就會(huì)發(fā)生顯著變化，蜂王漿的各種活性成分損失，其保健功能就會(huì)大幅降低，甚至喪失[34]。

我國(guó)蜂業(yè)生產(chǎn)的現(xiàn)實(shí)是蜂農(nóng)轉(zhuǎn)地放蜂，餐風(fēng)露宿，生活條件十分艱苦。野外生活根本不可能有冰柜把生產(chǎn)的蜂王漿及時(shí)冷凍。很多收購(gòu)商一周時(shí)間到蜂王漿生產(chǎn)集中的蜂農(nóng)那里收購(gòu)一次。零散的放蜂戶生產(chǎn)的蜂王漿可能室溫保存時(shí)間獲更長(zhǎng)。因此蜂王漿的新鮮度受到極大挑戰(zhàn)。我國(guó)是蜂王漿生產(chǎn)和出口大國(guó)，世界各國(guó)對(duì)蜂王漿的品質(zhì)要求日趨嚴(yán)格，但現(xiàn)行的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍具有局限性和單一性，因而，有必要探求和確定能真實(shí)、準(zhǔn)確反映蜂王漿在條件變化下的品質(zhì)指標(biāo)，并建立快速、高效的蜂王漿品質(zhì)變化鑒別方法是行業(yè)發(fā)展的需求。

優(yōu)質(zhì)蜂王漿10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）指標(biāo)應(yīng)適當(dāng)提高

蜂王漿是天然的功能性保健品，其保健功能在于其含有的多種生物活性物質(zhì)。又因?yàn)榉渫鯘{自身具有抑菌功能，只要包藏得到，取漿后無(wú)需任何后期加工，其所含生物活性物質(zhì)也能夠長(zhǎng)期保存。因此，對(duì)蜂王漿品質(zhì)的全面評(píng)價(jià)需要兼顧真?zhèn)魏托迈r度兩方面。

10-HDA是一種特殊的不飽和脂肪酸，又稱王漿酸，在自然界中，僅蜂王漿中存在此種特殊的生物活性物質(zhì)[35]。又因10-HDA在蜂王漿中含量穩(wěn)定，國(guó)際公認(rèn)其為蜂王漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)現(xiàn)行國(guó)標(biāo)《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蜂王漿》（GB 9697-2008）將蜂王漿分為優(yōu)等品和合格品兩個(gè)等級(jí)，規(guī)定其中10-HDA含量分別為≥1.8%和≥1.4%。2016年9月，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）正式頒布的由中國(guó)、日本、法國(guó)、意大利、德國(guó)、土耳其、美國(guó)、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、印度、阿根廷、巴巴多斯等國(guó)家共同參與制定的蜂王漿國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 12824 : 2016）中也對(duì)10-HDA進(jìn)行規(guī)定，要求不得低于1.4%。而外銷出口蜂王漿中10-HDA含量一般要求在2.0%以上。10-HDA的經(jīng)典和標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為高效液相色譜法，此方法準(zhǔn)確、易操作。

但大量研究證實(shí)10-HDA非常穩(wěn)定，即使在高溫下也不會(huì)大量分解[30,36]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，室溫存放24周，蜂王漿中10-HDA的含量沒有顯著變化。因而，10-HDA并不適合作為蜂王漿新鮮度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但作為蜂王漿真假的判斷標(biāo)準(zhǔn)，其含量能在一定程度上反應(yīng)蜂王漿的質(zhì)量[21,37]。

蜂王漿中10-HDA含量受地理位置和花期影響而有所不同。研究發(fā)現(xiàn)云南省2009 年野藿香和2010年石榴、鬼針草3種植物生產(chǎn)的6種蜂王漿樣品中，10- HDA含量均在1.8%～2.1%[38]。湖北、安徽等地蜂群生產(chǎn)的15個(gè)新鮮油菜蜂王漿樣品中10- HDA含量范圍為1.7%～1.9%[39]。來(lái)自我國(guó)19個(gè)省138個(gè)蜂王漿樣品的10-HDA含量，發(fā)現(xiàn)我國(guó)西部地區(qū)10-HDA含量（2.01±0.05 %）顯著高于東部地區(qū)(1.75±0.03%)和東北部地區(qū)(1.87±0.05%)；而不同花期10-HAD含量也不同，油菜、椴樹和荊條花期蜂王漿中10-HDA含量分別為1.92%、1.80%和1.68%[40]。我們于2015年、2016年、2017年6～8月連續(xù)3年在北京地區(qū)進(jìn)行蜂王漿生產(chǎn)試驗(yàn)，分別為2.16±0.14%，2.08±0.06%，2.21±0.04%（圖1），3年間的測(cè)定結(jié)果差異不顯著[41]，均高于1.8%。由此可見，蜂王漿中10-HDA含量受地理位置和花期影響而有所不同。綜合我國(guó)生產(chǎn)實(shí)際，優(yōu)質(zhì)蜂王漿的中10-HDA 含量應(yīng)高于1.8%。

2015年，2016年和2017年的6至8月連續(xù)3年在北京地區(qū)進(jìn)行蜂王漿生產(chǎn)試驗(yàn)，測(cè)定其中10-HDA含量。每年獲取20箱蜂3輪的生產(chǎn)數(shù)據(jù)。

圖1 不同年份生產(chǎn)蜂王漿中10-HDA含量

蜂王漿主蛋白含量變化可真實(shí)反應(yīng)蜂王漿新鮮度，應(yīng)納入優(yōu)質(zhì)蜂王漿質(zhì)量指標(biāo)

蜂王漿具有重要的生物學(xué)功能與其含有的MRJPs密切相關(guān)[26,42]，在蜜蜂生物學(xué)方面，MRJPs 參與決定蜂群中雌性蜂的級(jí)型分化[43,44]，為幼蟲發(fā)育提供必要的可利用氮元素以及可能在蜜蜂行為調(diào)控中起作用等[45-47]。另外，MRJPs 對(duì)其他動(dòng)物機(jī)體具有作用，主要表現(xiàn)為高效的抗菌活性，較強(qiáng)的免疫活性和促進(jìn)特殊細(xì)胞增殖等[48]。例如，MRJP2具顯著的有抗菌活性[49]；MRJP3在體內(nèi)外均有免疫調(diào)節(jié)作用[50]。MRJP功能證據(jù)少，發(fā)給你的文章里有很多 因而，MRJPs在蜂王漿中的含量直接影響蜂王漿的功能，是蜂王漿品質(zhì)的標(biāo)志。

蜂王漿主蛋白作為評(píng)價(jià)蜂王漿新鮮度的標(biāo)準(zhǔn)并非我們第一次提出。日本科學(xué)家Kamakura 等人在2001年提出，隨著溫度升高和儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，蜂王漿中MRJPs的含量也顯著降低，其中一種57kD的蛋白可作為評(píng)價(jià)蜂王漿新鮮度的指標(biāo)[30]，實(shí)際上這種蛋白是MRJP1，也有人建立了ELISA法，通過準(zhǔn)確定量MRJP1濃度來(lái)評(píng)價(jià)蜂王漿新鮮度[51]，但含量在蜂王漿最高，做新鮮度指標(biāo)不合適，并且一直未能在產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用。采用檢測(cè)靈敏度較高的雙相電泳和飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用的方法發(fā)現(xiàn)，在4℃和-20℃的存放條件下，儲(chǔ)存1年后，MRJPs含量顯著降低，特別是MRJP3、MRJP4和MRJP5；特別是室溫存放一年后，MRJPs已經(jīng)降解嚴(yán)重，MRJP3-5已經(jīng)檢測(cè)不到；建議采用MRJP5作為評(píng)價(jià)蜂王漿新鮮度的標(biāo)準(zhǔn)[52,53]。

最近我們通過高分辨質(zhì)譜和生化檢測(cè)驗(yàn)證對(duì)蜂王漿中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行了一個(gè)隨貯存溫度和時(shí)間的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)蜂王漿中可溶性蛋白質(zhì)隨貯存溫度的升高和時(shí)間的加長(zhǎng)都有很大程度的降解；MRJP1-5的含量最高，且含量穩(wěn)定，占總可溶性蛋白的80%以上，易于檢測(cè)；其中，MRJP1和MRJP2含量最高，但表現(xiàn)對(duì)溫度不敏感，在室溫和4℃存放4周降解不明顯，甚至在37℃能夠穩(wěn)定存在1周。MRJP3-5對(duì)溫度非常敏感，在室溫和4℃存放隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降解，在室溫存放2周開始，3種蛋白含量開始顯著降低；MRJP4在這3中蛋白中含量最低，對(duì)高溫也更加敏感，在37 ℃條件下存放3天，MRJP4就已經(jīng)完全降解而檢測(cè)不到（圖2）。因此，MRJP3和MRJP4作為蜂王漿質(zhì)量（新鮮度）檢測(cè)的標(biāo)記物最佳。

圖2 不同溫度存放不同時(shí)間后MRJP1，MRJP2，MRJP3和MRJP4含量Western-Blotting檢測(cè)

根據(jù)上述原理，為了準(zhǔn)確對(duì)這幾種蜂王漿主蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量，我們針對(duì)MRJP1-5制作了單抗，能夠明確區(qū)分這5種同源性較高的蛋白質(zhì)。利用MRJP3和MRJP4的單抗，我們已經(jīng)研發(fā)制作成了雙夾心ELISA試劑盒，分別對(duì)這兩種蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量。雙夾心ELISA需要獲得針對(duì)受檢蛋白的一對(duì)異性抗體，先將一種特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢樣品中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記的另一特異性抗體與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量。由于采用了特異性抗體對(duì)，大大減少了假陽(yáng)性反應(yīng)。在進(jìn)行同源性較高蛋白家族中某一種蛋白的定量時(shí)更加準(zhǔn)確。雙夾心ELISA試劑盒體系穩(wěn)定、準(zhǔn)確性高，在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用非常廣泛[54-56]，也被應(yīng)用于國(guó)家和地方檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。因而，通過對(duì)這兩款試劑盒平行性和穩(wěn)定性的多次檢測(cè)，確定這兩款試劑盒能夠做到對(duì)MRJP3和MRJP4的準(zhǔn)確定量從而評(píng)定蜂王漿的新鮮度。

結(jié)論

基于上述研究進(jìn)展與分析測(cè)試，我們認(rèn)為優(yōu)質(zhì)蜂王漿的10-HAD含量至少應(yīng)為1.8%；同時(shí)MRJP3和MRJP4應(yīng)增加為優(yōu)質(zhì)蜂王漿新鮮度的判定指標(biāo)，其含量應(yīng)分別大于或等于0.8g/100g和0.2g/100g。由于理論研究和技術(shù)創(chuàng)新問題，蜂王漿新鮮度在現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)都未曾涉及，但基于目前技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r，將MRJP3和MRJP4作為新鮮度指標(biāo)時(shí)機(jī)基本成熟。將此新鮮度指標(biāo)作為優(yōu)質(zhì)蜂王漿指標(biāo)具有一定的創(chuàng)新，對(duì)引領(lǐng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

蜂王漿對(duì)我國(guó)蜂產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要，也是最具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力、最具高附加值的蜂產(chǎn)品。作為世界蜂王漿生產(chǎn)和出口第一大國(guó)，我們不僅只是生產(chǎn)大國(guó)，而且要通過科技創(chuàng)新，形成支撐產(chǎn)業(yè)發(fā)展的理論，通過技術(shù)創(chuàng)新和產(chǎn)品創(chuàng)造，實(shí)現(xiàn)引領(lǐng)消費(fèi)，最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型。通過對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)蜂王漿成分、功能研究以及蜂王漿標(biāo)準(zhǔn)的研讀，我們?cè)诂F(xiàn)有蜂王漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，嘗試性提出了我國(guó)優(yōu)質(zhì)蜂王漿的標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)我國(guó)蜂產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。