郭壯，董蘊(yùn)，尚雪嬌，倪慧，周明會(huì)，張振東*

(1.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.襄陽農(nóng)錦食品有限公司，湖北 襄陽 441053)

牛肉醬使用牛肉為主要原料，添加天然香辛料，經(jīng)蒸、煮、熬等多道工序精制而成，營養(yǎng)全面均衡，在全國范圍內(nèi)均有消費(fèi)市場。鮮肉經(jīng)過熱加工制成各種熟肉制品后理應(yīng)不含菌體，但是由于工藝或者其他原因，可能會(huì)有微生物在牛肉醬中殘留下來，進(jìn)而在后期貯藏中產(chǎn)生生物膜和腐敗。生膜微生物在牛肉醬中進(jìn)行繁殖，不僅影響到牛肉醬的外觀、氣味、滋味。有些微生物還可能會(huì)產(chǎn)生一些毒素，一些侵襲性的微生物還可能會(huì)造成食物中毒等事件，危及到食用人群的健康。由于很多種酵母對(duì)低溫有很好的適應(yīng)性，因此冷藏通常只能減緩食品腐敗的發(fā)生[1]。

通常情況下，引起肉類食品生膜腐敗的微生物有霉菌、酵母和細(xì)菌。牛肉醬是一種高油和高蛋白含量的食品，所以能引起牛肉醬腐敗的微生物通常能分解油脂，能夠利用蛋白質(zhì)來獲取能量。研究表明，醬肉中的腐敗菌以腸桿菌屬微生物、芽孢桿屬、微球菌群等細(xì)菌微生物與絲狀真菌和酵母為主。引起食品腐敗的酵母有：高鹽的大頭菜中Candidapararugosa，Candidazemplinina等腐敗酵母[2]，引起糖漿、醬油等食品腐敗的Candidapelliculosa，Candidalambica，Geotrichumcandidum[3]，能夠利用脂肪而引起高脂肪食品腐敗的Candida，Cryptococcus，Geotrichum與Rhodotorula等。本文從襄陽市區(qū)牛肉醬企業(yè)收集到1瓶生膜牛肉醬樣品，采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法對(duì)生膜微生物進(jìn)行了分離與鑒定，使用分子生物學(xué)方法對(duì)分離到的微生物進(jìn)行了鑒定，并驗(yàn)證了它們對(duì)牛肉醬的生膜能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛肉醬

2017年9月從湖北省襄陽市牛肉醬生產(chǎn)企業(yè)收集的生膜牛肉醬1瓶及剛加工的新鮮牛肉醬1000 g。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2；PDA培養(yǎng)基：使用合成培養(yǎng)基(海博，青島)；YPD培養(yǎng)基配方：1% 酵母膏，2% 蛋白胨，2%葡萄糖，調(diào)節(jié)pH至7.2。

1.1.3 主要儀器

電子天平 賽多利斯公司；-70 ℃冰箱、生物安全柜 青島海爾股份有限公司；組織研磨器 美國Biospec公司；隔水式培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；離心機(jī) 日本日立公司；PCR儀 美國ABI公司；恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛肉醬生膜菌的分離與純化

生膜細(xì)菌的分離采用傳統(tǒng)的平板劃線法進(jìn)行：取生膜牛肉醬1塊，將接種環(huán)在酒精燈上灼燒滅菌、冷卻后，挑取生膜醬塊上的含生物膜菌團(tuán)，劃線于LB固體平板上培養(yǎng)3～5天。根據(jù)菌落形態(tài)的不同，挑取菌落形態(tài)具有差異的菌，并在LB固體平板上劃線純化至少3次，然后將純化的細(xì)菌進(jìn)行染色鏡檢后使用30%甘油于-40 ℃冰箱保存。

生膜真菌的分離方法同生膜細(xì)菌：取生膜牛肉醬，挑取生膜醬塊上的菌膜，劃線于PDA固體平板后于25 ℃培養(yǎng)3～5天。根據(jù)菌落形態(tài)的不同，挑取菌落形態(tài)具有差異的菌，并在PDA固體平板上劃線純化至少3次，然后使用30%甘油于-40 ℃冰箱保存。在保存前，將純化過的微生物未染色直接鏡檢與染色鏡檢。

1.2.2 牛肉醬腐菌DNA提取

牛肉醬中生膜菌的鑒定：將純化過的微生物培養(yǎng)1～2天后收獲菌體，將菌體使用TE緩沖液重懸，并加入0.2 g玻璃珠(直徑0.5 mm)后在組織研磨器中破碎菌體細(xì)胞，接著加入10% SDS、蛋白酶K，于55 ℃水浴90 min后，使用酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)抽提1次，接著使用氯仿-異戊醇(24∶1)抽提1次后取上清，加入2倍體積無水乙醇沉淀DNA，然后晾干并用無菌TE緩沖液溶解DNA，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，保存于-20 ℃冰箱備用[4]。

1.2.3 牛肉醬腐菌的鑒定

使用酵母菌26S rDNA的D1/D2區(qū)通用引物NL1(5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′)與NL4 (5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′)[5]，以提取的生膜菌總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用AxyPrep PCR清潔試劑盒純化，并連接到pMD18-T克隆載體后，轉(zhuǎn)化到Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。接著使用M13引物，取在LB液體(含氨芐青霉素)過夜培養(yǎng)的克隆子進(jìn)行PCR，并用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)克隆子進(jìn)行驗(yàn)證，然后挑取陽性克隆子送南京金絲瑞生物科技有限公司測序。待測序后，將去除引物NL1與NL4的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取最相近的序列與分離到的菌株序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析生膜菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.3 生膜菌對(duì)牛肉醬的生膜能力

取正常加工的牛肉醬100 g分裝于玻璃瓶中，首先進(jìn)行巴氏殺菌。待牛肉醬冷卻后，接入培養(yǎng)好的菌液，并于25 ℃培養(yǎng)，每天觀察牛肉醬的情況，待牛肉醬生膜后，進(jìn)行拍照并描述牛肉醬的組織狀況。

2 結(jié)果

2.1 牛肉醬腐菌的分離與純化

劃線分離與倍比稀釋法是分離微生物的基本方法，許多研究都采用這些方法對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物進(jìn)行分離。本研究使用劃線分離法對(duì)牛肉醬中的生膜微生物進(jìn)行了分離與純化。從PDA固體平板上微生物L(fēng)JJ11，從LB培養(yǎng)基上獲得了3株微生物L(fēng)JJ1、LJJ2、LJJ3。分離到的4株微生物在PDA固體平板上的菌落形態(tài)及它們的鏡檢圖片見圖1。

圖1 牛肉醬生膜菌形態(tài)Fig.1 The morphology of biofilm-forming yeasts

通常情況下，LB培養(yǎng)基主要用來分離與純化細(xì)菌。由圖1可知，從LB固體培養(yǎng)基上分離到的3株微生物L(fēng)JJ1、LJJ2、LJJ3與LJJ11顯微形態(tài)一致，菌體細(xì)胞大小明顯大于普通的細(xì)菌，推斷分離到的4株菌均為酵母菌。單個(gè)酵母細(xì)胞呈卵圓形，而多個(gè)細(xì)胞聚集在一起時(shí)，出現(xiàn)不規(guī)則的多邊形菌體，酵母細(xì)胞可被結(jié)晶紫染色，染色后在顯微鏡下酵母細(xì)胞呈卵圓形。在PDA固體平板上生長2天后，這4株菌的菌落形態(tài)均表現(xiàn)為白色凸起，奶油樣外觀，菌落周圍整齊，表面光滑濕潤。

2.2 生膜酵母的PCR擴(kuò)增

對(duì)酵母菌LJJ1、LJJ2、LJJ3與LJJ11菌體總DNA進(jìn)行了提取，然后使用真菌26S rDNA基因D1/D2區(qū)通用引物NL1與NL4進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2，可知PCR產(chǎn)物片段約為600 bp，符合真菌26S rDNA基因D1/D2區(qū)段大小，可以進(jìn)行下一步的克隆并進(jìn)行測序。

圖2 生膜酵母26S rDNA基因D1/D2區(qū)PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of D1/D2 region of 26S rDNA gene of biofilm-forming yeasts

2.3 生膜酵母的鑒定

酵母菌大亞基上26S rDNA分子，可分為 D1、D2～D12等多個(gè)區(qū)域，其中D1/D2區(qū)域，序列相對(duì)比較保守，長度為600 bp左右。而酵母18S rDNA序列長達(dá)1800 bp，測序較繁瑣，且多數(shù)酵母菌均能使用26S rDNA中Dl/D2區(qū)進(jìn)行區(qū)分[6]。針對(duì)26S rDNA基因D1/D2區(qū)仍然無法區(qū)分的酵母，可采用ITS間區(qū)或者一些持家基因如TEF1，CYTB，RPB等序列加以區(qū)分[7,8]。

使用通用引物NL1與NL4通過PCR獲得了分離到的4株酵母的26S rDNA基因D1/D2區(qū)序列，并將這些序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果見表1。

表1 分離到的4株酵母NCBI BLAST比對(duì)結(jié)果Table 1 NCBI Blast of isolated 4 yeast strains

由表1可知，4株菌與Candidametapsilosis(近平滑假絲酵母)序列相似度最高。但是與Candidametapsilosis，Candidaparapsilosis，Candidaorthopsilosis3個(gè)種的酵母菌株序列相似度也超過了99%。有研究人員將Candida屬一些生理生化性狀相似，26S rDNA基因D1/D2區(qū)序列相似的酵母菌組成一個(gè)Candidaparapsilosiscomplex[9]，而系統(tǒng)發(fā)育分析也證實(shí)了它們的同源性較高，在系統(tǒng)發(fā)育樹上能聚成一個(gè)分支。

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載序列相似度超過98%的序列，與分離到的4株酵母菌序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析以確定它們的分類地位，見圖3。

圖3 基于生膜菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of biofilm-forming yeasts based on D1/D2 region 26S rDNA gene

由圖3可知，它們與Candidametapsilosis系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，并與Candidaparapsilosis，Candidametapsilosis，Candidaorthopsilosis聚成一個(gè)分支，表明它們都屬于Candidaparapsilosiscomplex。這4株酵母菌26S rDNA基因D1/D2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明，它們均屬于Candidametapsilosis，而它們的菌落形態(tài)與顯微鏡下的形態(tài)與Candidaparapsilosiscomplex符合，因此綜合分子生物學(xué)方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，這4株酵母菌均屬于Candidametapsilosis，為Candidaparapsilosiscomplex的一個(gè)分支。

目前國內(nèi)對(duì)Candidaparapsilosiscomplex的研究仍然較少，國外的研究主要針對(duì)Candidaparapsilosiscomplex的感染性與分類方面。2004年，基于ITS等序列的MLST分析，Tavanti等[10]將Candidametapsilosis與Candidaorthopsilosis一起確立為種水平上的新分類單元。2007年，Gácser等[11]指出，C.orthopsilosis與C.parapsilosis對(duì)人體組織的損傷程度較為相似，而C.metapsilosis的毒性更小一些。Candidaparapsilosiscomplex是人類皮膚表面的一種正常菌群之一，?？稍谥讣紫麻g隙分離到。但是它們也是一種機(jī)會(huì)致病菌，感染之后能導(dǎo)致多種疾病：真菌血癥、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和內(nèi)眼炎等的發(fā)生。

2.4 分離菌的生膜性分析

將生膜菌接入新鮮的經(jīng)過滅菌的牛肉醬中，在25 ℃常溫培養(yǎng)7天后，牛肉醬的外觀發(fā)生了顯著變化，見圖4。

圖4 生膜菌致牛肉醬腐敗實(shí)驗(yàn)Fig.4 Experiment of spoilage of beef sauce caused by biofilm-forming bacteria

牛肉醬肉塊表面長滿了黃色的菌膜，且LJJ1、LJJ2、LJJ3與LJJ11 4個(gè)處理的牛肉塊表面的組織狀態(tài)類似。而對(duì)照未接菌處理的牛肉醬表面仍然保持與第0天的牛肉醬組織狀態(tài)一致，說明分離到的4株Candidaparapsilosiscomplex中Candidametapsilosis酵母確實(shí)是引起這種牛肉醬生膜的微生物。

Candidaparapsilosiscomplex能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如谷胱甘肽、GABA及各種酶如木糖還原酶等，還可用于肉類發(fā)酵，有較好的應(yīng)用價(jià)值。將Candidaparapsilosis與普洱茶共發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)接種菌株的普洱茶樣品的GABA含量顯著較高[12]。也有研究人員使用Candidaparapsilosis進(jìn)行(S)-苯基乙二醇的生物制備[13]。

與其他食品不同，牛肉醬是一種高油脂、高蛋白及高鹽食品。據(jù)報(bào)道，一些酵母能產(chǎn)生豐富的蛋白酶，降解肉類制品中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生低分子量的硫化物如H2S和SO2，造成食品的營養(yǎng)價(jià)值與氣味變化。這些酵母多為Candida屬，如Candidazeylanoides和Candidaalimentaria，而關(guān)于Candidametapsilosis對(duì)造成肉類食品生膜的報(bào)道尚少。

3 總結(jié)

酵母菌是一種常見的腐敗菌，能導(dǎo)致肉類、果蔬、面食等的腐敗。本研究從腐敗的牛肉醬肉塊上分離到的4株微生物均為酵母菌，經(jīng)過菌落形態(tài)、顯微細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的觀察及系統(tǒng)發(fā)育分析得出它們均屬于Candidametapsilosis，且它們均能導(dǎo)致新鮮無菌牛肉醬產(chǎn)生黃色膜狀腐敗。