房國(guó)梁 趙杰修 張漓 李鵬飛

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所（北京100061）

阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種多發(fā)于老年人，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力衰退為主要臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。AD的致病原因眾多，如β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）積聚、微管相關(guān)蛋白tau異常磷酸化以及鈣平衡失調(diào)等等。目前越來(lái)越多的研究表明氧化損傷也是導(dǎo)致AD發(fā)生的重要原因[2]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是造成機(jī)體氧化損傷的主要物質(zhì)，它是由線粒體產(chǎn)生的一類(lèi)含氧的單電子還原產(chǎn)物。隨著年齡的增長(zhǎng)ROS逐漸積累，對(duì)機(jī)體的氧化損傷程度不斷加深[3]。研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦中ROS含量明顯增加[4]，ROS可以激活β-分泌酶1（Beta-secretase 1，BACE1）和γ-分泌酶，使β-淀粉樣前體蛋白（amyloid β-protein precursor，APP）通過(guò)淀粉樣蛋白途徑降解，導(dǎo)致Aβ含量增多[5]；同時(shí)ROS還能激活相關(guān)蛋白激酶，導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化產(chǎn)生神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofbrillary tangles，NFTs）[6]；另一方面，Aβ和NFTs又可以誘導(dǎo)ROS的生成和線粒體功能障礙，產(chǎn)生更多的ROS[7]；這些都加速了AD的產(chǎn)生。

而Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/核因子 E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2 p45-related factor 2，Nrf2）信號(hào)通路在機(jī)體抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。正常生理?xiàng)l件下，Nrf2與Keap1相偶聯(lián)，經(jīng)泛素化修飾后被蛋白酶體快速降解[9]。而在氧化應(yīng)激條件下，Keap1與Nrf2的DLG基序解偶聯(lián)，但仍與ETGE基序結(jié)合，導(dǎo)致Keap1構(gòu)象發(fā)生改變，抑制了Nrf2的泛素化降解過(guò)程；使Keap1與Nrf2的結(jié)合處于飽和狀態(tài)，而不斷合成的Nrf2轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與肌腱纖維瘤蛋白（muscloaponeurotic fibrosarcoma protein，Maf）形成異源二聚體，促使Nrf2識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE），啟動(dòng)下游抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[10]。

大量研究表明，長(zhǎng)期有規(guī)律地體育運(yùn)動(dòng)能夠有效延緩AD的發(fā)生，但是其機(jī)制尚不明確。有氧運(yùn)動(dòng)在改善大腦功能、延緩AD發(fā)生過(guò)程中，是否通過(guò)影響Keap1/Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮積極作用，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)人報(bào)道。因此，本研究通過(guò)觀察8周有氧運(yùn)動(dòng)后APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中Keap1/Nrf2信號(hào)通路各因子的變化情況，闡明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Keap1/Nrf2信號(hào)通路及腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響，為揭示有氧運(yùn)動(dòng)改善大腦功能、延緩AD發(fā)生提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組

實(shí)驗(yàn)選用24周齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠20只，體重為28.68±3.44 g，購(gòu)自北京中科澤晟科技有限公司。隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（CG，n=10）和運(yùn)動(dòng)組（EG，n=10）。每籠2只小鼠，自由進(jìn)食飲水，光照比為12 h∶12 h，溫度20 ±2℃，相對(duì)濕度40～60%。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠是一種廣泛使用的AD模型小鼠，可表達(dá)突變的人類(lèi)早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉樣前蛋白（APPswe）融合體，導(dǎo)致早發(fā)性老年癡呆癥，6～7月齡APP/PS1小鼠腦內(nèi)即可檢測(cè)到β淀粉樣蛋白沉淀的形成[11]。

1.2 訓(xùn)練方案

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，所有小鼠先進(jìn)行1周的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，速度為9 m/min，每天訓(xùn)練10 min，連續(xù)訓(xùn)練5天。休息2天后，EG組小鼠按表1中的方案進(jìn)行8周跑臺(tái)訓(xùn)練。跑臺(tái)坡度為0，每周一至周五訓(xùn)練，周六、日休息2天。而CG組小鼠則一直處于安靜狀態(tài)。

表1 8周跑臺(tái)訓(xùn)練方案

1.3 樣品制備

在最后一次訓(xùn)練結(jié)束后48 h，所有小鼠用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉，然后斷頭取腦，在冰上迅速分離相同部位大腦皮質(zhì)和兩側(cè)海馬組織，放入液氮冷凍。然后將樣品轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存待測(cè)。由于小鼠腦組織較小，每組隨機(jī)取其中5只的樣品進(jìn)行氧化應(yīng)激水平檢測(cè)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，另外5只的樣品進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.4 氧化應(yīng)激水平檢測(cè)

測(cè)定小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量，以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）的活力。所有操作均按照碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

將小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織分別放入冰預(yù)冷的玻璃勻漿器中，然后加入1 ml Trizol裂解液，充分勻漿，使組織細(xì)胞裂解，采用氯仿異丙醇法提取大腦皮質(zhì)和海馬組織總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。然后利用各目的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。引物序列見(jiàn)表2。最后根據(jù)各反應(yīng)孔的ct值，計(jì)算各組目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物合成序列

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

將小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織在液氮中研磨后，迅速加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液進(jìn)行細(xì)胞組織的充分裂解。4℃，12000×g離心15 min，取200 μl上清液然后加入50 μl 5×蛋白上樣緩沖液，放入100℃水浴鍋中進(jìn)行蛋白變性，持續(xù)10 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h，然后將膜與稀釋好的一抗4℃孵育過(guò)夜（實(shí)驗(yàn)中用到的一抗APP、Aβ42、BACE1、Nrf2、Keap1、Maf、HO-1、NQO1和GCLC抗體均購(gòu)自Abcam公司；β-actin抗體購(gòu)自碧云天公司）。次日用TBST洗膜3次，每次5 min，洗去殘留一抗，然后將膜與稀釋好的二抗室溫孵育1 h（實(shí)驗(yàn)中用到的二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Beyotime公司），然后用TBST洗膜4次，每次5 min，以洗去殘留的二抗。最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑和X光片檢測(cè)蛋白信號(hào)。

1.7 灰度分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用ImageJ軟件進(jìn)行Western blot條帶的灰度分析，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，文中所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，顯著性檢驗(yàn)選擇雙尾t檢驗(yàn)。P＜0.05表示有顯著性差異；P＜0.01表示有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)APP/PS 1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織Keap 1/Nrf 2信號(hào)通路活性

通過(guò)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EG組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中Keap1 mRNA水平與CG組相比并無(wú)顯著性變化（圖1A）；但EG組Nrf2和Maf的mRNA水平顯著高于CG組，其中Nrf2為CG組水平的2.36倍和2.75倍（P＜0.01，圖1B），Maf為CG組水平的1.96倍和2.13倍（P＜0.01，圖1C）。Western blot方法檢測(cè)小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中Keap1、Nrf2和Maf的蛋白水平發(fā)現(xiàn)，EG組Keap1的蛋白水平與CG組相比同樣無(wú)顯著性變化（圖1D、E）；而EG組Nrf2和Maf的蛋白水平顯著高于CG組，其中Nrf2為CG組水平的1.61倍和1.75倍（P＜0.01，圖1D、F），Maf為CG組水平的1.52倍和1.65倍（P＜0.01，圖1D、G）。上述結(jié)果說(shuō)明8周有氧運(yùn)動(dòng)后APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中Nrf2和Maf在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著提高，從而增強(qiáng)了Keap1/Nrf2信號(hào)通路的活性。

圖1 各組小鼠Keap1、Nrf2和Maf的mRNA和蛋白水平比較

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)提高Keap 1/Nrf 2信號(hào)通路下游抗氧化蛋白含量

如圖2所示，EG組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、NADPH醌氧化還原酶1（NADPH dehydrogenase quinone 1，NQO1）和谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）的mRNA水平均顯著高于CG組，其中HO-1為CG組水平的3.22倍和3.67倍（P＜0.01，圖2A），NQO1為CG組水平的2.83倍和3.26倍（P＜0.01，圖2B），GCLC為CG組水平的2.46倍和2.80倍（P＜0.01，圖2C）。EG組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中HO-1、NQO1和GCLC的蛋白水平也都顯著高于CG組，其中HO-1為CG組水平的2.36倍和3.10倍（P＜0.01，圖2D、E），NQO1為CG組水平的2.61倍和2.95倍（P＜0.01，圖2D、F），GCLC為CG組水平的1.71倍和1.84倍（P＜0.01，圖2D、G）。上述結(jié)果說(shuō)明8周有氧運(yùn)動(dòng)能夠顯著提高Keap1/Nrf2信號(hào)通路下游抗氧化蛋白含量，從而提高大腦皮質(zhì)和海馬組織抗氧化能力。

圖2 各組小鼠HO-1、NQO1和GCLC的mRNA和蛋白水平比較

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)降低APP/PS 1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織氧化應(yīng)激水平

如圖3所示，EG組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中MDA含量顯著低于CG組（P＜0.05，P＜0.01，圖3A），而GSH含量顯著高于CG組（P＜0.01，圖3B），同時(shí)GSHPx（P＜0.05，圖3C）和T-SOD（P＜0.05，圖3D）的酶活力也顯著高于CG組。上述結(jié)果說(shuō)明Keap1/Nrf2信號(hào)通路下游抗氧化蛋白含量的提高，能夠顯著降低APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織的氧化應(yīng)激水平。

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)降低AP/PS 1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織Aβ蛋白水平

通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EG組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中APP的含量與CG組相比并沒(méi)有顯著差異（圖4A、B）；而Aβ42的含量顯著低于CG組，分別約為CG組水平的53.0%和45.1%（P＜0.01，圖4A、C）；EG組BACE1的含量也顯著低于CG組，分別約為CG組水平的41.1%和45.2%（P＜0.05，圖4A、D）。上述結(jié)果說(shuō)明8周有氧運(yùn)動(dòng)降低了APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中BACE1的含量，減少了APP通過(guò)淀粉樣蛋白途徑降解，從而有效降低了Aβ蛋白水平。

圖3 各組小鼠MDA和GSH的含量及GSH-Px和T-SOD的酶活力

圖4 各組小鼠APP、Aβ42和BACE1的蛋白水平比較

3 討論

氧化損傷是導(dǎo)致AD發(fā)生的一個(gè)重要因素，隨著年齡的增長(zhǎng)ROS在體內(nèi)不斷積累，對(duì)機(jī)體氧化損傷逐漸加深[3]。大量研究表明AD患者腦中ROS含量與正常人相比顯著增加[4]。ROS可以激活β-分泌酶和γ-分泌酶，使APP通過(guò)淀粉樣蛋白途徑降解，增加Aβ含量[5]。此外，ROS還可與脂類(lèi)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)反應(yīng)，其產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[12]。這些都加速了AD的產(chǎn)生。

Keap1/Nrf2信號(hào)通路對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)具有重要調(diào)控作用，并且該信號(hào)通路的激活對(duì)延緩AD有積極作用。研究發(fā)現(xiàn)AD模型小鼠腦中Nrf2、NQO1和GCL等抗氧化酶的mRNA水平降低，Aβ積聚增加[13]。同時(shí)在AD患者腦中也發(fā)現(xiàn)Nrf2含量與正常人相比顯著下降[14]。而Kanninen等[15]向AD模型小鼠海馬組織中注射編碼Nrf2的慢病毒載體，6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，并且編碼Nrf2、HO-1的mRNA含量增加。此外，通過(guò)體外培養(yǎng)野生型和Nrf2缺陷型小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，并在野生型干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Nrf2，發(fā)現(xiàn)Nrf2過(guò)表達(dá)能夠抑制Aβ蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，而在Nrf2缺陷型干細(xì)胞中Aβ誘導(dǎo)減少神經(jīng)分化的程度加重[16]。上述研究均表明Keap1/Nrf2信號(hào)通路的激活能夠提高神經(jīng)元細(xì)胞的抗氧化能力、減輕神經(jīng)氧化損傷，從而延緩AD進(jìn)程。

越來(lái)越多的研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可以減少體內(nèi)氧化自由基的產(chǎn)生，提高機(jī)體抗氧化能力[17，18]，并對(duì)延緩大腦衰老、防治AD具有積極作用[19-21]。但是在上述過(guò)程中Keap1/Nrf2信號(hào)通路是否在其中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)人報(bào)道。

我們?cè)诒狙芯恐羞x取了大腦皮質(zhì)和海馬組織兩種具有不同結(jié)構(gòu)和功能的腦組織進(jìn)行了檢測(cè)。大腦皮質(zhì)位于大腦的表層，是機(jī)體的最高級(jí)神經(jīng)中樞，控制著聽(tīng)覺(jué)、視覺(jué)、觸覺(jué)、情感、抽象思維、語(yǔ)言、判斷和軀體運(yùn)動(dòng)等多種高級(jí)功能[22]；海馬組織位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，負(fù)責(zé)信息存儲(chǔ)，控制著學(xué)習(xí)與記憶[23]。這兩種腦組織是AD病變最為顯著的區(qū)域，表現(xiàn)為老年斑的出現(xiàn)[24]、NFTs的形成[25]和神經(jīng)元的大量丟失等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，8周跑臺(tái)訓(xùn)練后APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中Keap1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平并沒(méi)有發(fā)生顯著變化，而Nrf2和Maf在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均顯著提高，從而增強(qiáng)了Keap1/Nrf2信號(hào)通路的活性。由于該通路活性的增強(qiáng)其下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1和GCLC在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平也顯著上升，從而提高了大腦皮質(zhì)和海馬組織抗氧化的能力。另外，通過(guò)試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MDA的含量明顯下降，GSH的含量明顯上升，GSH-Px和SOD的酶活力顯著提高，也驗(yàn)證了大腦皮質(zhì)和海馬組織抗氧化能力的提高和氧化應(yīng)激水平的降低。氧化應(yīng)激水平的降低有效抑制了小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中β-分泌酶的活性，表現(xiàn)為BACE1含量降低，從而減少了APP通過(guò)淀粉樣蛋白途徑的降解，最終降低了Aβ蛋白的形成。上述改變對(duì)于改善AD具有積極作用。此外，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬組織中Keap1/Nrf2信號(hào)通路的活性和下游抗氧化蛋白的影響更為顯著。

4 結(jié)論

綜上所述，有氧運(yùn)動(dòng)能夠增強(qiáng)APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織Keap1/Nrf2信號(hào)通路活性，提高通路下游抗氧化蛋白含量，降低氧化應(yīng)激水平，從而有效抑制Aβ蛋白的形成，對(duì)于改善阿爾茨海默癥具有積極作用。