趙彥華，張紀(jì)兵，薛暉

（1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2.南京智億生物技術(shù)有限公司，江蘇 南京 211100）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科，氣單胞菌屬，是嗜溫、有動力的氣單胞菌群，是一種典型人-獸-魚共患病病原[1]。嗜水氣單胞菌目前已經(jīng)在自然界被廣泛分離到，如在淡海水魚[2-3]，淡水蝦、蟹類[4]和養(yǎng)殖蛙體內(nèi)[5-6]，被確認(rèn)為多種水產(chǎn)動物重要的病原菌，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雙氧水作為氧化性消毒劑，含有大量的過氧化氫，使用過程中能夠迅速釋放大量新生氧，對細(xì)菌組分發(fā)生氧化作用，干擾其酶系統(tǒng)從而發(fā)揮抑菌及殺菌作用[7]。近年來雙氧水作為控制魚類病原體的一種化學(xué)藥劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面得到了極高的重視[8]。該試驗的目的在于測試一種新型過氧化物在增氧的同時，對池塘水中細(xì)菌的抑制和殺滅效果。

1 材料與方法

1.1 材料

新型過氧化物（Na2SO2·Nacl·H2O2），由南京智億生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基及胰蛋白胨生理鹽水溶液購自環(huán)凱生物制品有限公司，3M細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)片購自南京邁默瑞生物技術(shù)有限公司，供試菌株嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國農(nóng)業(yè)微生物保存中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌懸液的制備 將嗜水氣單胞菌菌株用LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行搖床增菌培養(yǎng)，28℃，180 rad/min，培養(yǎng)5 h，離心，棄上清，用滅菌胰蛋白胨生理鹽水溶液洗下菌苔，制成菌懸液，按照倍比稀釋的方法，進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，調(diào)整濃度，備用。

1.2.2 使用濃度為0.1 g/mL時抑菌效果試驗 按照使用說明書，將新型過氧化物使用濃度調(diào)整為說明書用量十分之一，即0.1 g/mL加入到菌懸液中，每隔15 min，吸取菌懸液并按照倍比稀釋方法進(jìn)行稀釋，稀釋后不同濃度菌懸液各吸取1 mL加入3M細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)試紙片上進(jìn)行壓片，連續(xù)監(jiān)測6 h，試紙片放入28℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。

1.2.3 使用濃度為1 g/mL時殺菌效果試驗 將新型過氧化物按照使用濃度調(diào)整，即1 g/mL加入到菌懸液中，每隔15 min，吸取菌懸液并按照倍比稀釋方法進(jìn)行稀釋，稀釋后不同濃度菌懸液各吸取1 mL加入3M細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)試紙片上進(jìn)行壓片，連續(xù)監(jiān)測6 h，試紙片放入28℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌懸液制備

嗜水氣單胞菌經(jīng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，制得菌懸液濃度為8.2×106CFU/mL。

2.2 抑菌試驗結(jié)果

過氧化物使用濃度為0.1 g/L時，檢測結(jié)果如表1所示，當(dāng)加入過氧化物2 h 45 min時，細(xì)菌濃度最低，且濃度為3.1×106CFU/mL，細(xì)菌濃度下降明顯，隨著時間推移，細(xì)菌濃度隨即增加，表明此濃度抑菌效果較好，但并不能完全殺滅菌體。

2.3 殺菌試驗結(jié)果

過氧化物使用濃度為1 g/L時，檢測結(jié)果如表2所示，當(dāng)加入過氧化物1 h 15 min時，細(xì)菌全部殺死，表明該過氧化物殺菌效果明顯。

表1 過氧化物抑菌試驗結(jié)果

表2 過氧化物殺菌試驗結(jié)果

2.4 抑菌及殺菌曲線圖

如圖1所示，A為抑菌曲線，B為殺菌曲線，隨著時間的推移，曲線A中細(xì)菌總數(shù)在2 h 45 min中時濃度最低，隨后細(xì)菌濃度上升；曲線B隨著時間的推移，細(xì)菌在1 h 15 min時被完全殺死，細(xì)菌數(shù)為零，且隨著時間的推移，并未檢測到細(xì)菌的存在。

圖1 過氧化物抑菌及殺菌曲線

3 討論

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高密度、集約化飼養(yǎng)及種質(zhì)資源的退化，水產(chǎn)病害日益增多，抗生素的過量使用，不僅僅造成耐藥株的產(chǎn)生，而且還會出現(xiàn)藥物殘留等食品安全問題，消毒劑不僅可以防治病害，又可以避免藥物殘留等問題的出現(xiàn)，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用。池塘消毒作為養(yǎng)殖的第一步，也是最重要的一步，如何挑選一種效果好，用量少，無污染，無殘留以及不易產(chǎn)生耐藥性的消毒劑是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一大問題。

嗜水氣單胞菌普遍存在于水環(huán)境中，是重要的水生病原菌之一。池塘養(yǎng)殖水環(huán)境，細(xì)菌總數(shù)一般為106CFU/mL，因此，該試驗?zāi)M水環(huán)境中細(xì)菌總數(shù)，培養(yǎng)嗜水氣單胞菌調(diào)整其濃度為8.2×106CFU/mL，通過固體過氧化物的溶解，進(jìn)行氧化作用抑制和殺滅細(xì)菌。該次試驗通過低濃度及正常濃度過氧化物的使用，來驗證一種新型過氧化物的抑菌及殺菌效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用消毒劑提供了一定的參考。