孫奴奴，李步高，曹果清，趙 銀，徐 濤

(1.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 晉中 030801)

抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(TAP)是由TAP1和TAP2兩種分子組成的異二聚體結(jié)構(gòu)，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族的B族，通常分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜上[1]，它的主要作用是把肽類在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過蛋白酶體一系列降解反應(yīng)之后，產(chǎn)生的片段輸入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，然后和MHC I類物質(zhì)聚合，最終引起T細(xì)胞的特異性反應(yīng)[2]。編碼TAP的基因位于MHCⅡ類區(qū)域，有遺傳多態(tài)性[3]。鑒于其在抗原遞呈中所起的重要作用，使它成為某些免疫性疾病易感基因的主要候選者，TAP的異常將嚴(yán)重影響抗原遞呈，成為病毒感染及腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的重要機(jī)制，如卵巢癌、肝癌及宮頸癌[4]。TAP的表達(dá)可以被某些細(xì)胞因子(如IFN-γ，IFN-α，TNF-α)和脂多糖等誘導(dǎo)[5]，TAP表達(dá)上調(diào)與MHCⅠ類分子遞呈和CTL殺傷功能的增強(qiáng)密切相關(guān)，因此人們也越來越關(guān)注TAP基因表達(dá)的調(diào)控。

近年來，TAP1基因在長白、大白、杜洛克和皮特蘭等國外豬種[6-7]以及梅山豬、霍壽黑豬、皖南黑豬、安慶六白豬、浦東白豬和蘇太豬等國內(nèi)地方豬種[8-11]的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，研究表明TAP1基因多態(tài)性在國內(nèi)外豬種的基因型分布有一定差異，TAP1基因不同基因型對斷奶仔豬F18大腸桿菌的抗性不同，TAP1基因在免疫組織和腸道組織的表達(dá)量較高，特別是在受到藍(lán)耳病毒、模擬病毒及大腸桿菌感染后[12-13]，TAP1基因的表達(dá)量顯著升高，因此將TAP1基因作為豬抗病育種的有效遺傳標(biāo)記之一。晉汾白豬是以馬身豬、太湖豬、長白豬及大白豬為親本經(jīng)歷6個(gè)世代20年于2012年培育成的瘦肉型豬新品種[14]。新山西黑豬是以馬身豬、內(nèi)江豬、巴克夏豬和國外豬種為親本經(jīng)歷10年培育的抗病力好、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美及養(yǎng)殖效益高的培育品種[15]。本研究通過PCR-RFP的方法研究了TAP1基因BSP143I多態(tài)位點(diǎn)在晉汾白豬和新山西黑豬的基因型分布，并利用RT-PCR方法檢測了TAP1基因在晉汾白豬和新山西黑豬在免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等18個(gè)組織的表達(dá)譜，為下一步研究TAP1基因作為抗病育種遺傳標(biāo)記在晉汾白豬和新山西黑豬的有效利用提供基本素材。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料

采集來自山西省運(yùn)城市新龍豐畜牧有限公司健康的晉汾白豬159頭和新山西黑豬57頭的耳組織置于75 %乙醇溶液中，-20 ℃保存?zhèn)溆?；分別采集斷奶仔豬晉汾白豬和新山西黑豬的18種組織(心、肝、脾、肺、巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、腎、淋巴結(jié)、子宮、胃、卵巢、皮膚、肌肉、脂肪、大腦、小腦、支氣管、盲腸)，液氮速凍并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱。

2×Taq PCR Master Mix，DNA Marker，RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA合成

采用酚/氯仿/異戊醇法抽提耳組織DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?；利用Trizol法提取豬各組織總RNA，用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用ND2000檢測RNA的純度及濃度，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩DNA合成：20 μL的反應(yīng)體系中含dNTP Mix (2.5mM each)4 μL，Primer Mix 2 μL，5-RT Buffer 4 μL，DTT(0.1M)，HiFiScript(200 U/μL) 1 μL，Total RNA 300 ng，RNase free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。合成的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

利用primer 5.0軟件，參考GeneBank序列BX323833設(shè)計(jì)引物，本實(shí)驗(yàn)引物是由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，序列如表1所示。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.4 PCR-RFLP分析

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：采用10μL反應(yīng)體系，即模板DNA 0.5 μL，上下游引物各0.2 μL (10 μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，補(bǔ)ddH2O至總反應(yīng)體系為10 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，有目的條帶的PCR產(chǎn)物經(jīng)BSP143I內(nèi)切酶37℃消化4 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照分型。

1.5 RT-PCR

以不同組織cDNA為模板，分別PCR擴(kuò)增TAP1基因和ACTB基因。采用10 μL反應(yīng)體系，即cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.2 μL(10 μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，補(bǔ)ddH2O至總反應(yīng)體系為10 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度60 ℃，退火時(shí)間30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照保存。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

基因分型結(jié)果利用popgene 32軟件進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，利用SAS8.1軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR引物的擴(kuò)增效果檢測

以豬基因組DNA為模版，進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到790bp左右的單一條帶，無雜帶污染，結(jié)果見圖1。

2.2 PCR-RFLP分析結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶Bsp143I消化后，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，晉汾白豬產(chǎn)生3種條帶，分別為AA(790bp)、AG(651 bp/139 bp，790 bp)和GG( 651 bp/139 bp)型，結(jié)果見圖2；新山西黑豬產(chǎn)生2種帶型，分別為AG(651 bp/139 bp，790 bp)和GG( 651 bp/139 bp)型，結(jié)果見圖3。

圖1 晉汾白豬和新山西黑豬PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 晉汾白豬PCR-RFLP電泳結(jié)果

圖3 新山西黑豬PCR-RFLP電泳結(jié)果

2.3 不同豬種中TAP1基因第3外顯子基因型及其等位基因頻率分析

基因型分型結(jié)果利用PopGen32軟件進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表2顯示，晉汾白豬中共檢測出A、G 兩種等位基因和AA、AG、GG 3種基因型，新山西黑豬檢測出A、G 兩種等位基因和AG、GG兩種基因型?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，晉汾白豬和新山西黑豬在TAP1基因Bsp143I酶切位點(diǎn)基因型符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

2.4 不同豬種TAP1基因外顯子3的遺傳特性分析

對晉汾白豬和新山西黑豬中所檢測到的TAP1基因的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，如表3所示，晉汾白豬雜合度和香農(nóng)指數(shù)較高，分別為0.3459，0.4797；新山西黑豬雜合度和香農(nóng)指數(shù)較低，分別為0.1228，0.2308，因此晉汾白豬和新山西黑豬表現(xiàn)具有一定的多態(tài)性。晉汾白豬 GG基因型數(shù)最多，其基因型頻率也最大，AA基因型數(shù)最少，晉汾白豬是G等位基因占優(yōu)勢；新山西黑豬GG基因型數(shù)也最多，其基因型頻率同樣也最大，AA基因型數(shù)沒有檢測到，可能群體數(shù)還不夠大，新山西黑豬是G等位基因占優(yōu)勢。

表3 晉汾白豬和山西黑豬PCR-RFLP的雜合度、純合度和香農(nóng)指數(shù)

2.5 不同豬種基因型分布差異性分析

對晉汾白豬和新山西黑豬中所檢測到的TAP1基因的多態(tài)位點(diǎn)運(yùn)用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行基因型分布的比較分析，檢測結(jié)果表明，晉汾白豬和新山西黑豬TAP1基因的多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布差異極顯著(χ2=182.8165，P<0.01)。

表4 TAP1基因在晉汾白豬和新山西黑豬中的基因型分布差異性檢測

2.6 TAP1在豬不同組織表達(dá)的RT-PCR電泳檢測結(jié)果

以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別以TAP1和內(nèi)參基因ACTB為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖4、圖5。

TAP1基因在晉汾白豬的18個(gè)組織均有表達(dá)，其中在心、肝、脾、腎、胃、卵巢、皮膚、肌肉、脂肪、大腦、小腦、支氣管、盲腸表達(dá)量較高，在肺、肺泡巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴結(jié)、子宮表達(dá)量較低；在新山西黑豬的18個(gè)組織均有表達(dá)，而且表達(dá)量均較高。

圖4 TAP1，ACTB在晉汾白豬不同組織

圖5 TAP1，ACTB在新山西黑豬不同組織表達(dá)的RT-PCR電泳結(jié)果

3 討論

不同動物個(gè)體疾病抗性的差異是可以遺傳的，抗性基因的單核苷酸突變在一定程度上與動物對疾病的抗性/易感相關(guān)，TAP1基因位于SLAⅡ類基因組區(qū)域內(nèi)，編碼的蛋白負(fù)責(zé)抗原的加工遞呈。本實(shí)驗(yàn)通過PCR-RFLP方法，在159頭晉汾白豬中檢測到3種基因型(AA、AG、GG)，在57頭新山西黑豬中檢測到2種基因型(AG、GG)，發(fā)現(xiàn)GG基因型是晉汾白豬和新山西黑豬的優(yōu)勢基因型，G為優(yōu)勢等位基因，并且均符合Hardy-Weinberg平衡，說明TAP1基因在晉汾白豬和新山西黑豬中基本是處于一個(gè)自由交配(Hardy-Weinberg平衡)的狀態(tài)，也就是群體的選育對TAP1基因沒有造成影響，對現(xiàn)在的選育性狀沒有作用。這與先前在長白、大白、杜洛克、皮特蘭和圣特西的研究結(jié)果一致[6-7，12]，而在霍壽黑豬、皖南黑豬、安慶六白豬、蘇太豬、浦東白豬和梅山豬等地方豬種的研究發(fā)現(xiàn)TAP1基因偏離了Hardy-Weinberg平衡[7-10]。雜合度是衡量群體遺傳變異大小的參數(shù)，雜合度越低，群體的遺傳一致性越高；香農(nóng)指數(shù)是衡量群體間分化水平的量度，是隨機(jī)交配群體在雜交選育過程中受到遺傳漂變、自然選擇和變異的綜合影響的度量[7]。本研究發(fā)現(xiàn)晉汾白豬的雜合度和香農(nóng)指數(shù)高于新山西黑豬的香農(nóng)指數(shù)，并且都高于長白豬的雜合度和香農(nóng)指數(shù)[12]，說明中國地方豬種的遺傳多態(tài)性比外來引進(jìn)豬種的豐富[7]。運(yùn)用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件分析進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果表明晉汾白豬和山西黑豬TAP1基因的多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布差異性極顯著(P<0.01)，一方面可能由于新山西黑豬沒有檢測到AA基因型造成的，另一方面新山西黑豬個(gè)體數(shù)較少，而且個(gè)體之間存在全同胞或半同胞的血緣關(guān)系。

TAP蛋白作為抗原肽的運(yùn)輸載體，在抗原遞呈及免疫應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵的作用，因此TAP1基因的表達(dá)量會影響其抗原遞呈的功能，當(dāng)TAP1基因表達(dá)量升高時(shí)會增強(qiáng)機(jī)體抵御細(xì)菌或病毒的能力，或者機(jī)體在受到病毒或細(xì)菌的攻擊時(shí)，機(jī)體血液或組織中的TAP1基因的mRNA水平會顯著升高[12-13]。本研究分析了TAP1基因在晉汾白豬和新山西黑豬(斷奶仔豬)各18個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示TAP1基因在晉汾白豬的肝、脾(免疫組織)，胃、盲腸(消化組織)，腎、卵巢(泌尿生殖組織)，心、支氣管(循環(huán)呼吸組織)，大腦、小腦(神經(jīng)組織)以及皮膚、肌肉、脂肪的表達(dá)量均比較高；TAP1基因在新山西黑豬的免疫、消化、泌尿生殖、循環(huán)呼吸及神經(jīng)組織等18個(gè)組織均有較高的表達(dá)。而先前我們發(fā)現(xiàn)成年梅山豬TAP1基因選擇性地在淋巴結(jié)、骨髓、肺、脂肪、皮膚、胃、腎、附睪、膀胱、子宮、卵巢表達(dá)[12]，另有研究發(fā)現(xiàn)TAP1基因的表達(dá)在35日齡的斷奶豬比8、18日齡的未斷奶的肺、脾、淋巴結(jié)、十二指腸和空腸表達(dá)量高[16]，一方面說明斷奶仔豬一般抗病力和機(jī)體免疫能力較弱，幾乎所有的組織都需要TAP1基因的高表達(dá)來抵御疾病的侵襲，成年豬對疾病的抵抗力加強(qiáng)，TAP1基因在呼吸、消化、泌尿生殖等組織選擇性地高表達(dá)；另一方面提示TAP1基因的高表達(dá)與抵御肺部、腸道、腎及子宮等部位的疾病有關(guān)。TAP1基因BSP143I多態(tài)位點(diǎn)的不同基因型也會影響組織的表達(dá)，zhao[11]等研究表明，GG基因型的個(gè)體在肝、肺、腎、胸腺、淋巴結(jié)、十二指腸和空腸的表達(dá)量比AG、AA基因型的個(gè)體高，wang[16]等研究發(fā)現(xiàn)TAP1基因在FUT1抗性型豬各免疫組織及腸道組織的表達(dá)均顯著高于敏感型豬。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對晉汾白豬和新山西黑豬TAP1基因在DNA水平及mRNA水平的研究，初步了解了TAP1基因BSP143I多態(tài)位點(diǎn)在山西兩個(gè)地方豬種的基因型分布及雜合度、香農(nóng)指數(shù)等群體遺傳學(xué)分析，以及斷奶仔豬18個(gè)組織的表達(dá)譜分析，為下一步TAP1基因作為抗病遺傳標(biāo)記用于山西地方豬種的抗病育種研究提供了基本的理論素材和指導(dǎo)依據(jù)。