徐清華，王娟，張鳳清，*

（1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012；2.長春市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，吉林長春130012）

利用超高壓提取技術(shù)提取人參的有效成分，乙醇回流法提取麥冬、肉桂、枸杞子，提取浸膏輔以蜂蜜制備了一款抗疲勞酒，擬申報(bào)具有緩解體力疲勞作用的保健酒。參麥酒中人參起主要作用[1-4]，人參被我國衛(wèi)生部列為新資源食品[5]。超高壓提取可以提高有效成分的提取率[6-8]。衛(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號）中規(guī)定，肉桂和枸杞子為藥食兩用品種，麥冬為我國保健食品可用品種。根據(jù)我國《保健食品備案與注冊管理規(guī)定》的要求，保健食品申報(bào)必須進(jìn)行毒理學(xué)安全性評價(jià)[9]，所以依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）對復(fù)方人參保健酒的急性毒性和遺傳毒性進(jìn)行了研究，以考察毒性級別和致突變作用，為注冊檢驗(yàn)提供技術(shù)支撐，同時(shí)也為保健食品的申報(bào)和技術(shù)審評提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料和方法

1.1 受試物

參麥酒，規(guī)格：100 mL/（瓶·d）。60℃減壓濃縮成20.83倍濃縮液作為本次試驗(yàn)受試樣品，受試樣品人體推薦劑量為4.80 mL/（人/d）。Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)均使用樣品20.83倍濃縮液。20.83倍濃縮液較稠，無法再度濃縮，高劑量組（人體推薦劑量100倍）采用酒基（50°）配制乙醇濃度無法調(diào)節(jié)到15%，故采用酒基（95°）調(diào)節(jié)各劑量組乙醇濃度至15%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)選用健康成年SPF級ICR小鼠20只，雌雄各半，動(dòng)物體重雌性為19.1 g～20.9 g，雄性為19.5 g～20.9 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2012-0004，合格證編號：201612900。微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)均選用南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖的SPF級ICR健康小鼠，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2016-0002。微核試驗(yàn)小鼠合格證編號：201616159；小鼠精子畸形試驗(yàn)小鼠合格證編號：201616161。

1.3 主要試劑與儀器

鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102：Molecular Toxicology，Inc.；大鼠肝 S-9 勻漿：江蘇齊氏生物科技有限公司；DT-1000電子天平、JJ-100電子天平、AL104型電子天平：上海精密儀器儀表有限公司；顯微鏡：OLYMPUS；SG-603生物安全柜：美國BAKER；電熱恒溫培養(yǎng)箱、SX-700高壓滅菌器、THZ-312型恒溫?fù)u床：常州首創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司。

1.4 飼養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在溫度為20.0℃～26.0℃、相對濕度為40%～70%的屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（蘇）2015-0009。輻照滅菌飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證：蘇飼證（2014）01008。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

用最大耐受量法進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)，設(shè)計(jì)劑量為20 000 mg/kg bw。動(dòng)物檢疫3 d，試驗(yàn)前動(dòng)物禁食16 d、自由飲水。樣品用無菌水配制，最大配制濃度為1 000 mg/mL，按最大灌胃量20 mL/kg bw，一次給樣，受試物給予劑量為20 000 mg/kg bw。給樣后連續(xù)觀察14 d，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.5.2 Ames試驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，選鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株 TA97、TA98、TA100、TA102，經(jīng)鑒定合格后進(jìn)行試驗(yàn)?；罨到y(tǒng)為β-萘黃酮和苯巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠肝S-9，S-9蛋白含量為30 mg/mL，其活力對2-氨基芴有良好的代謝激活能力。每100毫升S-9混合液中加10 mL S-9。陽性物：不加 S-9者為2，4，7-三硝基芴銅（TA97、TA98），甲基磺酸甲酯（TA100、TA102），加 S-9者為 2-氨基芴（TA97、TA98、TA100），1，8-二羥基蒽醌（TA102），同時(shí)設(shè)陰性對照組（未處理對照組和溶劑對照組）。在加與不加S-9混合液的情況下以5 000、1 000、200、40、8 μg/皿劑量進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)劑量組做3個(gè)平皿。樣品置于0.103MPa條件下高溫滅菌20min，在無菌條件下，稱量受試樣品并配制成溶液，受試樣品用無菌水配制成50 mg/mL，即高劑量組，用無菌水按一定倍比逐級稀釋配制成 10、2、0.4、0.08 mg/mL 4個(gè)劑量組，加樣量均為0.1 mL/皿。在2 mL頂層瓊脂中加入0.1 mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1 mL受試樣品溶液和0.5 mLS-9混合液（當(dāng)需要代謝活化時(shí)）?；靹蚝蟮谷氲讓优囵B(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。如果受試樣品組的回變菌落數(shù)是陰性對照組回變菌落數(shù)2倍以上，并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系則為陽性。整個(gè)試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)做一次。

1.5.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

選用體重25 g～30 g SPF級ICR小鼠60只，動(dòng)物購買后適應(yīng)環(huán)境3 d進(jìn)行試驗(yàn)。按體重隨機(jī)分為6個(gè)組，每組10只，雌雄各半。受試物人體推薦攝入量為：4.8 mL/（人/d）（體重按60 kg計(jì)），受試樣品人的推薦攝入量的100倍為：8.0 mL/kg bw，最高劑量設(shè)為8 mL/kg bw，設(shè) 2、4、8 mL/kg bw 3 個(gè)劑量組、陰性對照組（包括空白對照組：無菌水10 mL/kg·bw灌胃、溶劑對照組：含15%乙醇的酒基10 mL/kg bw灌胃）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40 mg/kg bw腹腔注射）。根據(jù)樣品的溶解性選擇95°基酒和無菌水配制，并調(diào)整各劑量組乙醇濃度為15%，低、中、高劑量組分別含受試樣品濃度為20%、40%、80%，以10 mL/kg bw灌胃，采用30 h給受試物法。兩次給受試樣品間隔24 h，第二次給受試樣品后6 h處死動(dòng)物，取胸骨常規(guī)制片、鏡檢，每鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞（polychromatic erythrocyte，PCE），觀察含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)并計(jì)算微核發(fā)生率，以千分率計(jì)，結(jié)果采用U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。每鼠計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞時(shí)所觀察到的成熟紅細(xì)胞數(shù)（normochromatic erythrocyte，NCE），并計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值（PCE/NCE）。

1.5.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

選用體重25 g～35 g SPF級ICR性成熟雄性小鼠30只，動(dòng)物購買后適應(yīng)環(huán)境3 d進(jìn)行試驗(yàn)。按體重隨機(jī)分為6組，每組5只。設(shè)2、4、8 mL/kg bw 3個(gè)劑量組、陰性對照組（包括空白對照組：無菌水10 mL/kg bw灌胃、溶劑對照組：含15%乙醇的酒基10 mL/kg bw灌胃）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40 mg/kg bw腹腔注射）。以10 mL/kg bw灌胃，每天1次，連續(xù)5 d。于首次給受試樣品后的第35天處死動(dòng)物，取兩側(cè)附睪精子濾液按常規(guī)制片、鏡檢。每鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，計(jì)算精子畸形發(fā)生率（以百分率計(jì)），結(jié)果采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.6 結(jié)果判定與統(tǒng)計(jì)

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)根據(jù)急性毒性劑量分級表對該受試物進(jìn)行分級。微核試驗(yàn)結(jié)果采用U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

參麥酒對小鼠體重和死亡數(shù)的影響見表1。

表1 參麥酒對小鼠急性經(jīng)口毒性的影響（±s）Table 1 Effects of ginseng ophiopogon liquor on acute oral toxicity in mice（±s）

表1 參麥酒對小鼠急性經(jīng)口毒性的影響（±s）Table 1 Effects of ginseng ophiopogon liquor on acute oral toxicity in mice（±s）

性別 動(dòng)物只數(shù)MTD/（mg/kg bw）雌 10 20.3±0.6 27.4±1.1 20 000 0 ＞20 000雄 10 20.2±0.5 33.2±1.3 20 000 0 ＞20 000體重/g 終體重/g 劑量/（mg/kg bw）初始 死亡只數(shù)

試驗(yàn)觀察期間，各組動(dòng)物飲食和活動(dòng)正常，生長良好，未見任何中毒表現(xiàn)及死亡。

2.2 Ames試驗(yàn)

參麥酒Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)見表2、表3。

表2 第一次參麥酒Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)（±s）Table 2 First time of ginseng ophiopogon liquor ames trial recall bacteria fall（±s）

表2 第一次參麥酒Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)（±s）Table 2 First time of ginseng ophiopogon liquor ames trial recall bacteria fall（±s）

注：**超過陰性對照組菌落數(shù)2倍以上。

-S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 TA97 TA98 TA100 TA102自發(fā)回變 0 mL 119±11 36±5 156±22 269±25 119±12 35±6 164±14 271±17無菌水 0.1 mL 114±14 34±7 148±19 287±12 121±11 36±5 165±16 276±12參麥酒 8 μg 119±17 37±6 167±20 279±25 107±10 35±6 166±11 274±25 40 μg 115±12 36±6 148±17 260±22 107±14 38±7 173±26 279±20組別 劑量（以每皿計(jì)）回變菌落數(shù)+S-9 200 μg 117±15 38±5 154±15 277±20 117±12 38±6 174±15 270±31 1 000 μg 119±13 38±4 165±18 290±10 125±15 39±4 164±17 269±26 5 000 μg 117±14 38±4 157±12 267±25 110±13 33±4 182±14 277±31 2-氨基芴 10 μL 1 145±121**3 532±197**2 874±107**1，8-二羥基蒽醌 50 μL 1 235±184**2，4，7-三硝基芴銅 0.2 μL 2 741±122** 2 625±143**甲基磺酸甲酯 1.0 μL 2 743±217** 3 295±194**

表3 第二次參麥酒Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)（±s）Table 3 Second time of ginseng ophiopogon liquor ames trial count（±s）

表3 第二次參麥酒Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)（±s）Table 3 Second time of ginseng ophiopogon liquor ames trial count（±s）

注：**超過陰性對照組菌落數(shù)2倍以上。

-S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 TA97 TA98 TA100 TA102自發(fā)回變 0 mL 112±16 38±4 184±10 283±25 117±16 38±6 176±21 271±16無菌水 0.1 mL 108±10 37±5 167±20 276±19 116±16 38±4 168±16 263±27參麥酒 8 μg 116±14 34±7 173±19 286±17 121±14 38±4 144±16 265±18 40 μg 116±11 38±5 175±18 272±22 120±13 36±6 148±17 287±14組別 劑量（以每皿計(jì)）回變菌落數(shù)+S-9 200 μg 120±18 37±4 161±22 253±12 122±16 36±5 160±16 257±12 1 000 μg 121±12 36±6 169±28 262±19 113±19 37±5 172±23 273±16 5 000 μg 111±13 36±7 174±21 268±20 109±19 34±4 187±13 273±29 2-氨基芴 10 μL 1 218±182**3 367±163**2 680±177**1，8-二羥基蒽醌 50 μL 1 265±108**2，4，7-三硝基芴銅 0.2 μL 2 717±80** 2 645±132**甲基磺酸甲酯 1.0 μL 2 383±172**3 427±151**

受試樣品溶液、溶劑對照、緩沖液以及S9混合物在無菌平板上均未觀察到受污染的菌落。各劑量組回變菌落數(shù)均未超過陰性對照組回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量-反應(yīng)關(guān)系。即參麥酒對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株試驗(yàn)菌株，在加與不加S-9時(shí)，均未見有致基因突變作用。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

參麥酒對小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率和嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值（PCE/NCE）的影響見表4。

表4 參麥酒對小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率和嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值（PCE/NCE）的影響Table 4 Effect of ginseng ophiopogon liquor on the incidence of micronucleus and the ratio of polychromatic erythrocyte to mature red blood cell（PCE/NCE）in bone marrow cells of mice

由表4可見，各劑量組微核率與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），而陽性對照組高于陰性對照組，有顯著性差異（P＜0.05）。受試物各劑量組的嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值（PCE/NCE）與對照組的差異均在對照組20%以內(nèi)，受試物對骨髓細(xì)胞增殖沒有抑制作用。未見參麥抗疲勞酒對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成及嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值（PCE/NCE）產(chǎn)生影響。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

參麥酒對小鼠精子畸形率的影響見表5。參麥酒對小鼠精子畸形類型及比例的影響見表6。

表5 參麥酒對小鼠精子畸形率的影響Table 5 Effect of ginseng ophiopogon liquor on sperm abnormality of mice

表6 參麥酒對小鼠精子畸形類型及比例的影響Table 6 Effect of ginseng ophiopogon liquor on type and proportion of sperm abnormalities in mice

由表5、表6可見，各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05），而陽性對照組小鼠精子畸形率高于陰性對照組，有顯著差異（P＜0.05）。因此參麥酒對小鼠精子畸形率未產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論與討論

《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003版規(guī)定了保健食品安全性毒理學(xué)評價(jià)的4個(gè)階段和內(nèi)容，按照不同保健食品選擇毒性試驗(yàn)的原則要求，本實(shí)驗(yàn)受試物有一個(gè)原料是新資源食品，兩個(gè)原料可藥食兩用，一個(gè)原料可以用做保健食品原料，故應(yīng)該進(jìn)行第一階段和第二階段的毒理學(xué)安全性評價(jià)。第一階段小鼠最大耐受劑量（maximumtolerateddose，MTD）20000mg/kgbw，大于15 g/kg，按食品急性毒性劑量分級標(biāo)準(zhǔn)判斷，受試物屬于無毒。通過致突變實(shí)驗(yàn)可以對受試物的遺傳毒性進(jìn)行考察，遺傳毒性的試驗(yàn)組合應(yīng)該綜合考慮原核細(xì)胞和真核細(xì)胞、生殖細(xì)胞和體細(xì)胞、體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)相結(jié)合的原則，本研究選用了Ames試驗(yàn)（細(xì)菌致突變試驗(yàn)）、小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)作為第二階段遺傳毒性檢測。結(jié)果，3項(xiàng)試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果為陰性。表明本實(shí)驗(yàn)條件下本受試物無遺傳毒性。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了人參、肉桂、麥冬、枸杞子單味藥材的毒性研究[10-19]。參麥酒無急性毒性和遺傳毒性，與其中單味藥的文獻(xiàn)報(bào)道一致。

朱薇薇[20]以高粱酒、海貍鼠肝（獺肝）、枸杞、制首鳥、蜂蜜、肉桂、甘草、山艾肉、龍眼肉、人參、牡蠣、丁香、海貍鼠鞭（獺鞭）為主要原料制成了三棟健酒，并對其進(jìn)行安全性毒理學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果未觀察到有毒副作用。洪麗華等[21]研究參杞紅瑪膠囊的急性毒性和遺傳毒性，參杞紅瑪膠囊由人參、枸杞、紅景天、瑪卡、淫羊藿等組成，在實(shí)驗(yàn)條件下，參杞紅瑪膠囊屬無毒級，未見遺傳毒性。人參、肉桂、麥冬、枸杞子四味藥材加以蜂蜜制成酒劑聯(lián)合毒性作用未見報(bào)道。本研究證實(shí)了參麥酒屬無毒級，未顯示致突變作用。研究結(jié)果為參麥酒注冊檢驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為保健食品申報(bào)提供毒理學(xué)基礎(chǔ)研究。