劉曉霓，劉秀紅 綜述，陳德喜 審校

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的 RNA，其中包括 rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNA和lncRNA等多種已知功能的RNA和未知功能的RNA。非編碼RNA在生物體的生命活動中發(fā)揮著極廣泛的調(diào)控作用，對其進行深入研究，可能對揭示基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因敲除、人類疾病防治及生物進化探索有重要意義[1]。DNA甲基化（DNA methylation）是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，DNA甲基化如同開關(guān)調(diào)控著許多腫瘤相關(guān)基因的表達，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。隨著人們對于非編碼RNA的認識，針對非編碼RNA甲基化相關(guān)研究也越來越多[2]。

微小 RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼 RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是目前研究較為熱點的非編碼RNA，其中microRNA、lncRNA甲基化異?？赡苁怯绊懜伟┌l(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生、發(fā)展[3，4]。本文將對近幾年microRNA、lncRNA甲基化與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進行綜述。

1 m icroRNAs甲基化與肝癌

microRNA是一種廣泛存在于真核生物、大小約為20-25個核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，降解或是阻遏靶mRNA，參與生命過程許多的重要進程。miRNAs功能失調(diào)是人類癌癥的共性，近年來miRNAs在HCC的甲基化狀態(tài)及其在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注[4]（表1）。

miRNA-200b可以明顯抑制肝癌細胞的增殖、克隆形成、細胞周期和侵襲。研究miRNA-200b和BMI1的生物學功能中發(fā)現(xiàn)83.3%的肝癌組織中miRNA-200b顯著下調(diào)，相反66.7%的肝癌組織BMI1過表達。報告基因結(jié)果顯示BMI1是miRNA-200b的靶基因。肝癌組織中miRNA-200b啟動子區(qū)CpG島甲基化水平增高，miRNA-200b相應(yīng)表達下降。miRNA200b部分被DNA甲基化而沉默，可以通過靶向作用BMI1抑制肝癌的進展[5]。miR-372可以調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞的細胞周期、凋亡、侵襲和預(yù)后，和腫瘤進展關(guān)系密切[6]。在肝癌細胞系和組織中檢測到miR-372上游相鄰CpG島的啟動子區(qū)高度甲基化，其在肝癌組織中的表達水平較低，與肝癌轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[7]。miR-106a在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，與啟動子低甲基化有關(guān)。報告基因檢測顯示tp53inp1和CDKN1A可能直接靶向作用于miR-106a。高表達miR-106a細胞具有更強的侵襲性，加快細胞周期進程，抗凋亡作用。miR-106a啟動子低甲基化，導(dǎo)致miR-106a表達上調(diào)可能有助于肝癌的進展[8]。miR-146a啟動子DNA甲基化與其表達下調(diào)與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為一個潛在的肝癌抑制因子[9]。miR-148a在多種癌癥中表達下調(diào)，可能是腫瘤抑制子，miR-148a過表達具有抑制HCC細胞增殖和周期進展的作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-148a由于GpG島超甲基化，介導(dǎo)其在HCC細胞的表達沉默。DNMT1過表達是miR-148a甲基化的原因[10]。miR-34家族作為癌變過程中腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。miR-34a、miR-34b/C的甲基化頻率均顯著高于癌旁非癌組織，miR-34b表達與CpG島甲基化呈負相關(guān)，提示DNA甲基化可能參與miR-34b在肝癌的失活[11]。MicroRNA-9調(diào)控失常見于多種腫瘤，探討HCC miR-9的表達和甲基化狀態(tài)與肝癌的相關(guān)性。結(jié)果顯示miR-9在HCC表達下調(diào)，甲基化頻率增高，與腫瘤大小相關(guān)。體外研究顯示其通過調(diào)控miR-9/IGF2BP1/AKT&ERK軸抑制肝癌細胞增殖和遷移作用，是潛在的治療靶標和預(yù)后標志物[12]。肝特異性 microRNA-122在多種 Huh7、HepG2和 QSG-7701肝癌細胞甲基化水平增高，表達下調(diào)，miRNA-122具有促進肝癌細胞凋亡作用，miRNA-122甲基化調(diào)節(jié)與肝癌進展相關(guān)[13]。DNA 甲基阻斷劑可以使miR-122在HCC表達明顯上調(diào)，PPARγ/RXRα復(fù)合物在miR-122表觀調(diào)控中發(fā)揮重要作用，HBX蛋白與PPARγ結(jié)合，抑制miR-122轉(zhuǎn)錄，丙型肝炎病毒沒有這種作用[14]。miR-101，是一個重要的肝癌腫瘤抑制miRNA，以c-Myc介導(dǎo)方式通過PRC2復(fù)合物而被表觀抑制。反過來，它又抑制兩個PRC2兩個亞單位（EZH2和EED），建立了肝癌發(fā)生的雙向負反饋環(huán)?；謴?fù)miR-101表達可以抑制 HCC細胞多個惡性表型（STMN1，JUNB，和CXCR7）。HCC 細胞共過表達c-Myc和EZH2與miR-101低表達和HCC患者不良預(yù)后有關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有HCC細胞系中miR-129-2高甲基化，表達下調(diào)。與癌旁組織比較，93%（39/42）HCC患者肝癌組織miR-129-2甲基化水平增高[16]。miR-129-2在肝癌細胞過表達，可以抑制增殖和克隆形成，與SOX4共表達可以部分逆轉(zhuǎn)其抗腫瘤作用，提示甲基化介導(dǎo)的miR-129-2表達抑制可能提高癌基因SOX4的表達，肝癌發(fā)生有關(guān)[17]。HBx和乙肝相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HBx在HepG2細胞誘導(dǎo)miR-132啟動子甲基化。MiR-132在HBV相關(guān)HCC組織中表達下降，和HBx表達相關(guān)[18]。HBx介導(dǎo)miR-101下調(diào)和DNMT3A上調(diào)增強多種抑癌基因的DNA甲基化，提示這可能是HBx介導(dǎo)肝癌發(fā)生的新的機制[19]。miR-335被宿主基因MEST內(nèi)含子所包含，miR-335的表達和MEST表達密切相關(guān)，說明內(nèi)含子miR-335與其宿主基因共表達，在HCC miR-335/MEST異常甲基化增高而致miR-335表達水平降低，與近處的轉(zhuǎn)移的HCC腫瘤相比，遠處轉(zhuǎn)移的HCC腫瘤表達顯著降低[20]。異位表達miR-517a和 miR-517c抑制細胞增殖和阻斷G2/M周期，HCC細胞用DNA甲基化阻斷劑處理后，miR-517a和 miR-517c表達上調(diào)，提示二者在HCC細胞處于高甲基化狀態(tài)，可通過調(diào)控Pyk2促進HCC的進展[21]。miR-23b具有抑制HCC的增殖和侵襲的生物學功能。與癌組織相比，miR-23b在HCC中的表達明顯降低，而且高表達miR-23b的患者的總生存期

（Overall survival，OS）和無病生存期（Disease-free survival，DFS）明顯延長，提示miR-23b是一個HCC預(yù)后的分子標志物。miR-23b的下調(diào)與DNA甲基化有關(guān)[22]。用芯片的比較有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 HCC患者肝癌組織的miR-129-3p表達情況，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織miR-129-3p表達明顯下調(diào)，其啟動子區(qū)高甲基化，提示miR-129-3p甲基化與肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)[23]。miR-615-5p體內(nèi)外具有抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移的作用。去甲基化酶KDM4B可以介導(dǎo) miR-615-5p啟動子CpG島甲基化，下調(diào)miR-615-5p在肝癌中的表達，miR-615-5p可以下調(diào)Ras相關(guān)蛋白RAB24，進而促進肝癌上皮間質(zhì)化、黏附和血管生長[24]。mir-1247-5p在多種癌細胞中起著不同的作用。在HCC，mir-1247-5p在HepG2細胞高度甲基化，肝癌臨床樣本及肝癌細胞株中mir-1247-5p轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)。mir-1247-5p異位表達明顯抑制HepG2細胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)細胞凋亡，并抑制移植瘤的體內(nèi)生長?？梢燥@著下調(diào)Wnt3表達，提示miR-1247-5p可以是HCC治療和診斷的潛在標志物[25]。miR-142參與調(diào)節(jié)癌癥患者腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成。miR-142在HCC中低表達，和TNM分期、轉(zhuǎn)移和分化有關(guān)。miR-142直接靶向抑制TGF-β，導(dǎo)致細胞活力、增殖、EMT和促血管生成的能力。miR-142在HCC的低表達與其高甲基化有關(guān)，可以增加TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤生長。

表1 m icroRNA DNA甲基化在HCC發(fā)生中的作用

可見，miRNA基因的缺失、突變、擴增或表觀遺傳沉默以及生物合成過程中的異常都可能導(dǎo)致miRNA表達水平的改變。而DNA甲基化可能是導(dǎo)致miRNA在腫瘤中表達沉默并影響其靶基因的表達和功能，進而影響腫瘤生物學行為的重要方式之一。miRNA DNA甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，為腫瘤的診斷及治療提供了新的方法。

2 lncRNAs與肝癌

lncRNA是一組長度大于200個核苷酸、缺少特異完整的開放閱讀框、無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。一方面證據(jù)顯示某些特定的lncRNAs是肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，同時大量的lncRNAs DNA甲基化和組蛋白修飾影響肝癌的關(guān)鍵信號通路。某些特定的lncRNA基因的異常甲基化修飾可能是包括肝癌等腫瘤預(yù)后不良的至關(guān)重要的事件。另一方面，盡管大量的lncRNAs通過全基因組的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA的表達調(diào)控在很大程度上仍然模糊。

Zeb1-as1是一個特定lncRNA，在肝癌（尤其是轉(zhuǎn)移性肝癌）中表達上調(diào)。DNA甲基化分析顯示zeb1-as1啟動子低甲基化，zeb1-as1低甲基化或zeb1-as1高表達與不良生存率相關(guān)。zeb1-as1促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，為肝癌的癌基因，提示zeb1-as1可作為HCC預(yù)后的生物標志物。研究lncRNA-SRHC在肝癌的表達在HCC發(fā)病機制中的作用發(fā)現(xiàn)SRHC能抑制肝癌細胞增殖，在肝癌組織低水平表達與血清AFP高水平以及和腫瘤低程度分化有關(guān)。SRHC啟動子區(qū)域CpG島DNA甲基化是其表達沉默的部分原因。lncRNA-MEG3（maternally expressed gene 3）作為腫瘤抑制基因，在HCC下調(diào)。lncRNA-MEG3啟動子顯示高甲基化狀態(tài)，MEG3表達的調(diào)節(jié)是依賴于靶向作用DNMT1的miR-29。甲基化相關(guān)的特異性調(diào)節(jié)MEG3表達顯示了lncRNA和基因表達的表觀遺傳調(diào)控之間的相互作用關(guān)系。lncRNA GAS5（Growth arrest special 5）過表達具有抗腫瘤細胞凋亡的作用。其啟動子的插入缺失多態(tài)性（rs145204276)和HCC的敏感性相關(guān)，rs145204276缺失可顯著增高HCC的風險。進一步表型分析顯示，在HCC，rs145204276等位基因缺失和GAS5高表達相關(guān)。rs145204276的基因表型和GAS5啟動子甲基化相關(guān)。rs145204276可能通過影響GAS5啟動子甲基化狀態(tài)有助于肝癌的形成。

此外，lncRNA除了自身DNA甲基化外，和抑癌基因以及miRNA的甲基化還存在交互作用，如反義lncRNA-TARID（for TCF21 antisense RNA inducing demethylation）與TCF21啟動子和GADD45A（growth arrest and DNA-damage-inducible，alpha；a regulator of DNA demethylation）相互作用，通過誘導(dǎo)啟動子去甲基化激活TCF21表達，提示lncRNA可以作為GADD45A介導(dǎo)的去甲基化的標簽。特異性的lncRNAs位于腫瘤相關(guān)基因附近，可能更易于作為各種作用子位點特異性甲基化關(guān)鍵招募平臺。lncRNA-HULC可以通過誘導(dǎo)miR-9啟動子CpG的甲基化激活miR-9表達。在肝癌靶向作用PPARA mRNA導(dǎo)致miR-9表達抑制，下調(diào)HCC脂質(zhì)代謝。提示受lncRNAs調(diào)控的下游基因的甲基化不受特異位點限制，為lncRNAs參與腫瘤相關(guān)基因的甲基化修飾提供更多的可能性。lncRNA-GIHCG在肝癌組織高表達，與肝癌大小、血管侵襲、腫瘤分期和不良預(yù)后有關(guān)，lncRNA-GIHCG可以通過招募 EZH2和 DNMT1到miR-200b/a/429啟動子區(qū)，促進miR-200b/a/429啟動子甲基化，沉默其表達。lncRNA-ZNFX1-AS1可以通過下調(diào)miR-9啟動子CpG島甲基化進而上調(diào)miR-9表達，抑制肝癌生長。lncRNA PCAT-14在肝癌病人中過表達，和肝癌手術(shù)以后的不良預(yù)后相關(guān)。PCAT-14可以促進肝癌細胞增殖、侵襲、阻滯細胞周期。此外，PCAT-14可以通過誘導(dǎo)miR-372啟動子甲基化進而抑制其表達，而miR-372可以抵消PCAT-14對HCC的促增殖、侵襲和阻滯細胞周期的作用。PCAT-14可以通過miR-372調(diào)控ATAD2表達，激活Hedgehog通路。lncRNA-GIHCG在肝癌組織高表達，與腫瘤大小、微血管侵襲、BCLC分期、不良預(yù)后密切相關(guān)。GIHCG招募EZH2和DNMT1到miR-200b/a/429啟動子區(qū)，促進miR-200b/a/429 DNA甲基化進而沉默其表達。

與miRNA相比，lncRNAs的表觀調(diào)控研究尚處于初期階段，lncRNAs DNA甲基化可能是未來腫瘤診斷和預(yù)后的重要因子。

3 結(jié)語

人類基因組中僅有約2%的DNA序列最終編碼生成蛋白質(zhì)，其余絕大部分區(qū)域轉(zhuǎn)錄形成非編碼RNA。非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄受到嚴格的調(diào)控，其表達譜細胞特異性和組織特異性甚至高于蛋白編碼基因。尋找和發(fā)現(xiàn)疾病過程中非編碼RNA表達變化的原因，了解非編碼RNA上游調(diào)控機制，是非編碼RNA研究領(lǐng)域重要組成部分，而表觀遺傳學正是從基因組層面研究RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要領(lǐng)域。

目前miRNAs甲基化與肝癌的關(guān)系研究較為廣泛和深入，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)，多種lncRNAs在肝癌中異常表達，可以作為抑癌或促癌基因參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。尤其近年來，有研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs也編碼微肽，lncRNAs表觀調(diào)控已成為肝癌乃至其他疾病發(fā)生發(fā)展的研究熱點。