， ， ， ，

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 呼和浩特 010031；2.中國(guó)科學(xué)院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心， 呼和浩特 010031；3.卓資縣農(nóng)牧業(yè)局， 內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012300)

化學(xué)誘變育種始于20世紀(jì)初，是通過(guò)誘變劑使植物產(chǎn)生可遺傳突變，結(jié)合育種目標(biāo)，通過(guò)對(duì)突變體進(jìn)行選擇和鑒定，育成遺傳穩(wěn)定的品系或品種[1-2]。此方法具有快速和高效的特點(diǎn)，已成為近幾年來(lái)應(yīng)用最為廣泛的誘變技術(shù)?；瘜W(xué)誘變劑約有上千種，其中甲基磺酸乙酯(EMS)由于誘變成本低、特異性強(qiáng)、頻率高、范圍廣等特點(diǎn)，成為公認(rèn)的應(yīng)用最廣、效果最好的化學(xué)誘變劑[3-4]。目前，在擬南芥[5]、小麥[6-7]、大麥[8]、水稻[9]、大豆[10]、玉米[11-12]、油菜[13]等作物中利用EMS誘變技術(shù)構(gòu)建了突變體庫(kù)。這些突變體庫(kù)，不僅為深入研究基因組學(xué)提供了優(yōu)良的材料，也為培育新品種提供了豐富的遺傳資源。

表1 不同EMS濃度及不同處理時(shí)間對(duì)黃花苜蓿種子萌發(fā)的影響

EMS濃度(%) 處理18h 處理24h 發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(shì)(%)發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(shì)(%)ck98.00±0.82a94.50±1.68a94.00±2.16a92.00±2.94a0.496.00±1.41a89.63±2.22a94.00±1.83a92.00±2.16a0.691.00±1.29b84.00±2.16b89.50±0.96b82.00±2.94b0.886.50±0.96c74.00±3.16c76.50±1.71c45.00±2.38c1.075.50±0.96d43.50±3.30d54.00±0.82d31.50±0.50d1.255.00±0.58e34.50±0.96de48.50±0.50e30.00±0.00de1.447.50±0.96f32.50±1.25e38.50±0.96f25.00±0.58ef1.643.00±1.29g32.50±0.96e33.50±0.96g22.00±0.00f1.833.50±0.96h29.50±1.71f28.50±1.50h23.00±2.38f2.024.00±1.41i15.00±1.00g21.00±1.29i15.50±0.50g

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。

苜蓿屬是重要的豆科牧草，生態(tài)類型豐富，因此，在誘變育種研究上也受到了學(xué)者們的重視。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用EMS誘變技術(shù)進(jìn)行了苜蓿突變體庫(kù)的構(gòu)建和新品系的培育[14-20]。苜蓿誘變育種的研究不僅豐富了苜蓿的基因源，也為苜蓿育種提供了基礎(chǔ)研究材料。黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)是具有重要價(jià)值的豆科牧草，具有較強(qiáng)的抗寒、抗旱、耐瘠薄等特點(diǎn)。但黃花苜蓿的草產(chǎn)量較低，在生產(chǎn)中直接利用較少。因此，進(jìn)行黃花苜蓿種質(zhì)創(chuàng)新尤為重要。本研究以蒙古國(guó)黃花苜蓿種子為材料，分析EMS 不同處理濃度對(duì)黃花苜蓿種子萌發(fā)的影響，從而獲得適宜的誘變劑量，為構(gòu)建蒙古國(guó)黃花苜蓿突變?nèi)后w奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

供試材料為蒙古國(guó)黃花苜蓿種子。試驗(yàn)用EMS(甲基磺酸乙酯)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 誘變處理

精選蒙古國(guó)黃花苜蓿種子，用磷酸緩沖液(100 mmol/L，pH=7.0)配置濃度分別為0，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%，1.8%，2.0%(v/v)的EMS溶液，使用不同濃度的EMS溶液在20 ℃，在120 r/min的搖床中分別處理種子18 h和24 h，處理完后在流水下沖洗4 h，以去除殘留的EMS。

1.4 發(fā)芽試驗(yàn)

分別對(duì)不同濃度，不同處理時(shí)間下的種子采用紙上發(fā)芽進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，每個(gè)處理4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，共統(tǒng)計(jì)14 d。第4天各處理隨機(jī)取10個(gè)幼苗利用游標(biāo)卡尺測(cè)定幼苗總長(zhǎng)度。根據(jù)發(fā)芽數(shù)和幼苗的生長(zhǎng)情況，分析誘變蒙古國(guó)黃花苜蓿種子的適宜劑量。

發(fā)芽勢(shì)(%)=(4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽率(%)=(供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差的計(jì)算及制圖，SAS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理對(duì)蒙古國(guó)黃花苜蓿種子萌發(fā)的影響

EMS對(duì)黃花苜蓿種子的萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制效果(表1)。當(dāng)EMS誘變時(shí)間一定時(shí)，隨著EMS處理濃度的增加，黃花苜蓿種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均呈降低趨勢(shì)。EMS誘變處理18 h時(shí)，0.4% EMS處理種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為88.50%和96.00%，與對(duì)照無(wú)顯著差異(p>0.05)而隨著處理濃度的增加，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均顯著降低，當(dāng)處理濃度達(dá)到1.4%時(shí)，種子的發(fā)芽率為47.50%，降幅50.50%，濃度為2.0%時(shí)，發(fā)芽率僅為24.00%，降幅72.00%；EMS誘變處理24 h時(shí)，隨著處理濃度的增加，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均呈下降趨勢(shì)，當(dāng)處理濃度為1.2%時(shí)，發(fā)芽率為48.50%，降幅45.50%，處理濃度為2.0%時(shí)，發(fā)芽率僅為21.00%，降幅73.00%。對(duì)于誘變時(shí)間，由表1可以看出，在同一EMS濃度下，黃花苜蓿種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均隨誘變時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，說(shuō)明誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響比較顯著。

2.2 EMS處理對(duì)蒙古國(guó)黃花苜蓿種子發(fā)芽進(jìn)程的影響

EMS誘變處理延遲了黃花苜蓿種子的發(fā)芽進(jìn)程(圖1，圖2)。與對(duì)照(ck)相比，18 h和24 h處理下的黃花苜蓿種子，除0.4%外，發(fā)芽高峰期均有所延遲，發(fā)芽整齊度降低。不同濃度的EMS處理種子18 h，發(fā)芽高峰期延遲2～5 d，發(fā)芽速率明顯減慢，隨著EMS濃度的增加，發(fā)芽時(shí)間逐漸延長(zhǎng)；不同濃度下EMS處理種子24 h，發(fā)芽高峰期延遲2～4 d，發(fā)芽速率也明顯減慢，發(fā)芽時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。

圖1 EMS處理18 h對(duì)黃花苜蓿種子萌發(fā)的影響

圖2 EMS處理24 h對(duì)黃花苜蓿種子萌發(fā)的影響

2.3 EMS處理對(duì)黃花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響

EMS浸種對(duì)黃花苜蓿的幼苗生長(zhǎng)有明顯抑制作用。如圖3、圖4所示，種子在不同EMS濃度下處理18 h和處理24 h后，幼苗的生長(zhǎng)情況產(chǎn)生明顯的變化，隨著EMS處理濃度的升高，幼苗生長(zhǎng)逐漸被抑制。處理18 h的種子，在EMS濃度達(dá)到1.0%時(shí)，幼苗高度與對(duì)照無(wú)顯著差異，當(dāng)EMS濃度達(dá)到1.2%時(shí)，幼苗高度由對(duì)照的5.19 cm降低到4.27 cm，濃度為2.0%時(shí)，幼苗高度僅為3.14 cm，均與對(duì)照差異顯著(p<0.05)。處理24 h的種子，在EMS濃度達(dá)到0.8%時(shí)，幼苗長(zhǎng)勢(shì)與對(duì)照無(wú)顯著差異，當(dāng)EMS濃度達(dá)到1.0%時(shí)，幼苗高度由對(duì)照的5.15 cm降低到3.38 cm，濃度為2.0%時(shí)幼苗高度僅為2.79 cm，均與對(duì)照差異顯著(p<0.05)。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。圖3 EMS處理18 h對(duì)黃花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響

圖4 EMS處理24 h對(duì)黃花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

EMS誘變對(duì)黃花苜蓿種子發(fā)芽影響的分析結(jié)果顯示，在2個(gè)處理時(shí)間下，隨著EMS濃度的增加，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及幼苗長(zhǎng)度均呈遞減趨勢(shì)，濃度越高，遞減趨勢(shì)越明顯，并且種子出現(xiàn)不同程度的腐爛，由此說(shuō)明高濃度的EMS對(duì)種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，并且對(duì)種子具有致死作用。這一現(xiàn)象與霍雅馨[17]在對(duì)甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿種子進(jìn)行誘變時(shí)得出的結(jié)論相似，種子發(fā)芽率降低，幼苗生長(zhǎng)被抑制。與對(duì)照(ck)相比，經(jīng)過(guò)EMS處理的種子發(fā)芽不整齊，種子的初始萌發(fā)時(shí)間被延遲，由此說(shuō)明EMS 處理在一定程度上對(duì)黃花苜蓿種子發(fā)芽初始時(shí)間和發(fā)芽進(jìn)程均具有延遲作用。

利用EMS進(jìn)行誘變育種，誘變的適宜條件很關(guān)鍵。不同植物間或同一物種的不同品種間以及同一植物的不同材料對(duì)誘變劑的敏感性是不同的。所以，最終的適宜誘變濃度也不同。因此，根據(jù)不同試驗(yàn)材料，選擇適宜的濃度十分重要。在苜蓿的EMS誘變研究中，霍雅馨研究得出，EMS對(duì)紫花苜蓿的適宜誘變劑量為0.8%，誘變時(shí)間18 h[17]，而吳興蘭等研究認(rèn)為，最適紫花苜蓿的EMS誘變半致死劑量為1.6%，處理時(shí)間為8 h[21]。本試驗(yàn)中，根據(jù)發(fā)芽率結(jié)合幼苗長(zhǎng)度綜合分析，認(rèn)為EMS對(duì)黃花苜蓿的適宜誘變時(shí)間和劑量分別為18 h和1.4%，與上述苜蓿的最佳誘變濃度存在差異，推測(cè)可能是材料不同導(dǎo)致。