袁璞珺，張競超

近年來，隨著我國社會老齡化問題的日益嚴峻，冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟?，CHD）的發(fā)病率一直居高不下，大大增加我國的醫(yī)療負擔(dān)。目前，臨床上主要采取經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）作為CHD的一線治療方案，但是易形成支架內(nèi)血栓，因此PCI術(shù)后輔以抗血小板藥物尤為重要[1]。氯吡格雷作為血小板表面二磷酸腺苷（ADP）受體拮抗劑，具有不可逆抑制血小板聚集的作用，廣泛用于CHD患者PCI術(shù)后抗血小板治療[2]。但是，有研究顯示，大約有4%～30%的患者對氯吡格雷缺乏反應(yīng)或反應(yīng)較低，稱為氯吡格雷抵抗[3]，及早診斷氯吡格雷抵抗對于選擇合理的抗血小板治療方案、預(yù)防微血栓形成具有十分重要的臨床價值。但是目前關(guān)于氯吡格雷抵抗的發(fā)生機制尚不明確，缺乏快速有效的特異性診斷手段，越來越多的研究證實，微小核糖核酸（miRNA）與血小板的活化密切相關(guān)[4]，但是關(guān)于miRNA與氯吡格雷抵抗發(fā)生的相關(guān)性研究尚少?；谇捌谘芯?，篩選血小板特異性高表達的miRNA作為候選標志物，包括miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223，通過實驗室方法檢測miRNA在PCI術(shù)后患者血小板中的表達情況，探討miRNA對氯吡格雷抵抗的潛在診斷價值?，F(xiàn)研究報告如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組連續(xù)入選2017年1月～2017年12月于河南省職工醫(yī)院心內(nèi)科行PCI術(shù)的CHD患者168例，其中男性95例，女性73例，年齡為46～79（61.43±7.26）歲。入選標準：所有患者經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心?。皇状畏寐冗粮窭追?；既往未接受過PCI術(shù)治療；由患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：不符合上述納入標準的患者；患者在治療前出現(xiàn)嚴重的意識障礙或心力衰竭者；合并嚴重的肝腎功能不全者；合并嚴重的血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染或伴有嚴重出血傾向者；合并惡性腫瘤者；氯吡格雷或阿司匹林禁忌者；受試前服用低分子肝素、抗感染藥物、抗抑郁藥物、苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥物者。根據(jù)檢測患者血小板聚集抑制率，分為氯吡格雷抵抗組（66例）和正常組（102例）。本項研究已獲得我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 治療方法根據(jù)患者的病情，在住院期間采取病因治療、一般治療、藥物治療等。病因治療：治療基礎(chǔ)疾病和消除誘因。一般治療：休息和控制鈉鹽的攝入等。藥物治療：所有CHD患者進行PCI術(shù)前給予300 mg負荷劑量的硫酸氫氯吡格雷片（商品名：波立維?，生產(chǎn)廠家：杭州賽諾菲制藥有限公司；生產(chǎn)批號：國藥準字J20130083 ），術(shù)后繼續(xù)服用氯吡格雷片劑75 mg/d至少12個月。

1.2.2 氯吡格雷抵抗診斷標準[5]采用光比濁法檢測以20 μmol/l二磷酸腺苷（ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集的通透度，血小板聚集活性（PAR）抑制率＜10%定義為氯吡格雷抵抗；否則為氯吡格雷反應(yīng)正常。血小板聚集抑制率=[（PAR處理前-PAR處理后）/PAR處理前]×100%。

1.2.3 血小板miRNA的檢測

1.2.3.1 純化血小板采集患者肘靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中；室溫下160 g離心6 min，取中層上清液，即為富血小板血漿；將富血小板血漿置于離心管中，室溫下300 g離心10 min，棄上清；加入3 ml Beads緩沖液重懸；加入40 ml人CD45磁珠beads試劑，室溫孵育45 min；采用磁性細胞分選系統(tǒng)收集血小板，采用流式細胞術(shù)檢測血小板純度。

1.2.3.2 提取總RNA收集血小板1×1010個，置于EP管中；加入1 ml預(yù)冷的Trizol，充分混合均勻，靜置5～10 min；加入200 μl氯仿，震蕩30 s，靜置5～10 min；12 000 rpm離心，取上清；加入500 μl異丙醇，震蕩30 s，靜置5～10 min；12 000 rpm離心，棄上清；加入1 ml 75%乙醇，震蕩30 s，12 000 rpm離心，棄上清；將EP管倒置于濾紙上，將RNA充分干燥；加入20 μl DEPC水溶解沉淀，分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆?。采用凝膠電泳檢測RNA分子量；采用分光光度計檢測RNA濃度。

1.2.3.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)Taqman? MicroRNA reverse transcription kit和Taqman? MicroRNA assay kit試劑盒（日本Takara公司）說明書操作進行。將cDNA保存至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）將25 μl反應(yīng)體系（12.5 μl SYBR Premix Taq+2 μl引物+2 μl模板+8.5 μl雙蒸水）置于37℃恒溫水浴60 min，85℃ 5 s，加入去離子水至100 μl，各反應(yīng)孔取2 μl進行PCR。冰浴中配制25 μl PCR反應(yīng)體系，95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s變性，60℃ 20 s退火，重復(fù)循環(huán)45次。引物序列如下： miR-26a（上游引物：5'-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'）；miR-26b（上游引物：5'-CAGCTTTGAGGTTCGTGTTTGT-3'；下游引物：5'- ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA-3'）；miR-23a（上游引物：5'-CAGCTTTGAG GTTCGTGTTTGT-3'；下游引物：5'-ATGCTCT TCTTTTTTGCGGAAA-3'）；miR-223（上游引物：5'-GTGTGGAGCAACATCTGGCCTCTA-3'；下游引物：5'- TTGGTTCAGCCACTGCCGAT-3'）；β-actin（上游引物：5'-TGGCG A T G G C A G T G T C T T A G-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'）。

1.2.4 觀察指標①血小板聚集情況：所有患者服用氯吡格雷之前采集靜脈血，以測定基礎(chǔ)水平血小板聚集情況，然后于治療結(jié)束后第2 d再次抽取靜脈血，再次測定血小板聚集情況。②血液生化指標：采用Beckman coulter AU680全自動血液生化分析儀（美國Beckman coulter）檢測白細胞計數(shù)（WBC）、紅細胞計數(shù)（RBC）、血小板計數(shù)（PLT）、血紅蛋白（HGB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、血清肌酐（SCr）、尿酸（UA）、B型腦鈉肽（BNP）水平。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。使用多因素logistic回歸分析氯吡格雷抵抗發(fā)生的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較比較兩組患者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）等基本資料，差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05，表1）。

2.2 兩組患者血小板聚集反應(yīng)情況變化兩組患者治療后，氯吡格雷抵抗組患者經(jīng)10 μmol/L、20 μmol/L ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分別為（11.81±2.54）%和（12.48±2.19）%，與治療前相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；但是高于氯吡格雷反應(yīng)正常組患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表1 患者的一般臨床資料分析

表2 兩組患者血小板聚集反應(yīng)情況（±s）

表2 兩組患者血小板聚集反應(yīng)情況（±s）

注：ADP：二磷酸腺苷；與本組治療前比較，aP＜0.05；與抵抗組治療后比較，bP＜0.05

項目 抵抗組（n=66） 正常組（n=102）治療前 治療后 治療前 治療后ADP（10 μmol/L）12.25±1.43 11.81±2.54 11.69±2.77 4.65±1.08ab ADP（20 μmol/L）14.16±3.15 13.28±3.04 13.97±2.53 5.74±1.21ab

表3 兩組患者血液生化指標比較

2.3 兩組患者血液生化指標比較比較兩組患者的生化指標，經(jīng)單因素分析結(jié)果顯示，兩組患者WBC、RBC、HGB值存在統(tǒng)計學(xué)差異（P均＜0.05）。為排除基線資料可能對本項研究結(jié)果產(chǎn)生的影響，對上述存在統(tǒng)計學(xué)差異的三項指標進行Logistc回歸分析，結(jié)果顯示，WBC、RBC、HGB不是發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨立危險因素（表3～4）。

表4 Logistic多因素回歸分析

表5 兩組患者血小板中miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223相對表達水平比較（±s）

表5 兩組患者血小板中miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223相對表達水平比較（±s）

項目 抵抗組（n=66） 正常組（n=102） P值miR-26a 1.86±0.18 0.53±0.15 0.000 miR-26b 0.47±0.14 0.44±0.09 0.093 miR-23a 0.43±0.16 0.39±0.22 0.204 miR-223 1.17±0.29 0.34±0.07 0.000

2.4 兩組患者血小板中miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223相對表達水平的差異性基于前期生物信息學(xué)研究的基礎(chǔ)上，選取miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223作為候選基因，比較兩組患者血小板中候選基因的表達情況，結(jié)果顯示，抵抗組患者血小板中miR-26a和miR-233表達水平明顯高于正常反應(yīng)組患者，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；其他兩種候選基因表達水平未見統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05）（表5）。

2.5 miR-26a和miR-233對于氯吡格雷抵抗的診斷價值經(jīng)ROC工作曲線分析miR-26a和miR-223對氯吡格雷抵抗的診斷價值，結(jié)果顯示，miR-26a ROC曲線的AUC為0.715（95%CI：0.565～0.865），miR-223 ROC曲線的AUC為0.831（95%CI：0.718～0.945），而miR-26a和miR-223聯(lián)合ROC曲線AUC為0.922（95%CI：0.848～0.997）。當(dāng)miR-26a相對表達量為1.24時，Youden指數(shù)最大，因此miR-26a的診斷閾值為1.24，此時miR-26a診斷氯吡格雷抵抗的敏感性為78.4%，特異性為60.5%；當(dāng)miR-223相對表達量為0.86時，Youden指數(shù)最大，因此miR-223的診斷閾值為0.86，此時miR-223診斷氯吡格雷抵抗的敏感性為82.3%，特異性為57.2%；另外，miR-26a和miR-223聯(lián)合診斷的敏感性和特異性分別為92.7%，87.6%。結(jié)果提示，miR-26a和miR-223聯(lián)合診斷價值高于單獨診斷價值（圖1）。

3 討論

冠心病作為一種嚴重危害人類健康的心腦血管疾病之一，死亡率和致殘率較高，病因復(fù)雜，給患者家庭增加極大的經(jīng)濟負擔(dān)。而急性心肌梗死是導(dǎo)致冠心病患者死亡的重要原因之一，與冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊破裂迅速形成血栓密切相關(guān)[6]。斑塊一旦破裂，血小板迅速聚集形成白色血栓，通常表現(xiàn)為非ST段持續(xù)抬高心肌梗死；若斑塊破裂嚴重，則會大量黏附纖維蛋白形成紅色血栓，導(dǎo)致冠狀動脈完全閉塞，形成ST段持續(xù)抬高心肌梗死[7]。目前對于心肌梗死的治療目的，首先需盡快恢復(fù)冠狀動脈的血流灌注，但是抗血栓治療也是治療的重要環(huán)節(jié)之一[8]。而氯吡格雷是預(yù)防冠心病患者臨床主要不良心血管事件發(fā)生的金標準[9]。

圖1 miR-26a、miR-223在氯吡格雷抵抗和正常反應(yīng)之間的ROC曲線

在本項研究中，采用臨床上最常使用的比濁度法用于檢測PCI術(shù)患者服用氯吡格雷前后的血小板活性，并根據(jù)血小板聚集抑制率分為抵抗組和正常反應(yīng)組，在此基礎(chǔ)上進行后續(xù)實驗。另有研究顯示，氯吡格雷抵抗可能與遺傳因素、吸煙史、糖尿病史等有關(guān)。在本項研究中，氯吡格雷抵抗組患者和正常反應(yīng)組患者一般臨床特征未見統(tǒng)計學(xué)差異，從而避免對研究目的的影響。氯吡格雷屬于新型抑制血小板聚集的噻吩砒啶類衍生物，主要通過不可逆地阻斷二磷酸肌酐受體，從而抑制纖維蛋白原與GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，從而抑制血小板聚集[10]。理論上，氯吡格雷具有很強的抗血小板活性作用，但是在實際臨床應(yīng)用中，很多患者服用氯吡格雷血小板后無反應(yīng)或低反應(yīng)。目前關(guān)于氯吡格雷抵抗的發(fā)生機制尚不明確，但普遍認為血小板活化因子在氯吡格雷抵抗發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[11]。經(jīng)血小板活化因子的誘導(dǎo)，ADP參與血小板聚集信號的放大過程[12]，血管受損后，血小板在膠原蛋白、血友病因子等影響下聚集到受損血管壁上，經(jīng)腎上腺素、降鈣素原等因子活化后，釋放ADP，激活血小板表面的糖蛋白受體，與纖維蛋白原結(jié)合，導(dǎo)致血小板聚集[13]。2003年，Muller等[14]學(xué)者首先提出氯吡格雷抵抗事件，并認為ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率＜10%即定義為氯吡格雷抵抗。

miRNA是真核生物基因中一類非編碼的負性調(diào)控RNA，可以通過與靶基因3’-非編碼區(qū)結(jié)合抑制RNA轉(zhuǎn)錄[15]。目前，關(guān)于miRNA與腫瘤和心腦血管疾病之間的關(guān)系研究已經(jīng)成為全球醫(yī)學(xué)界的熱點，但是國內(nèi)外在關(guān)于miRNA是否也參與氯吡格雷抵抗的發(fā)生以及哪些靶基因可能作為氯吡格雷抵抗診斷的候選標志物方面研究尚少。筆者通過前期生物信息學(xué)和基因芯片技術(shù)，初選氯吡格雷抵抗患者與正常反應(yīng)患者具有表達差異性的miRNA譜，結(jié)果顯示，氯吡格雷抵抗的患者血小板中miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223、miR-191、miR-484等多種基因呈高表達，選擇前四種基因作為本項研究的候選基因。另外，由于基因芯片技術(shù)雖然簡單易行，篩選信息量大，但是敏感度較低，而且成本昂貴，RT-qPCR是目前實驗室和臨床檢驗科最常使用的可靠的檢測方式，本項研究通過RT-qPCR檢測兩組患者血小板中miRNA的表達量。結(jié)果顯示，在miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223四種候選基因中，氯吡格雷抵抗組患者血小板中miR-26a和miR-233表達水平明顯高于正常反應(yīng)組患者，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），其他兩種候選基因表達水平未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。進一步分析miR-26a、miR-223對氯吡格雷抵抗的臨床診斷價值，結(jié)果顯示，miR-26a和miR-223單獨和聯(lián)合診斷ROC工作曲線下面積分別為0.715，0.831，0.922，特異性和敏感性分別為78.4%和60.5%，82.3%和57.2%，92.7%和87.6%，聯(lián)合診斷的臨床價值、敏感性和特異性明顯提高。

綜上所述，氯吡格雷抵抗患者血小板中miR-26a和miR-223表達較正常反應(yīng)者明顯上調(diào)，聯(lián)合檢測血小板中miR-26a和miR-223的表達水平可作為氯吡格雷抵抗的診斷方法，具有良好的臨床推廣價值。