張 權(quán)， 周貽兵， 林 野， 李 磊， 劉利亞， 劉文政， 吳玉田， 郭 華

(貴州省疾病預(yù)防控制中心中心實驗室,貴州貴陽 550004)

樣品前處理是農(nóng)藥殘留分析檢測的關(guān)鍵步驟，目前樣品前處理方法正朝著簡單化、節(jié)約化和微型化發(fā)展[1]。常用的農(nóng)藥多殘留前處理技術(shù)主要有基質(zhì)固相分散萃取[1]、固相萃取[2]、凝膠滲透色譜[3]以及QuEChERS法[4]等。QuEChERS法是一種快速、簡便、價格低廉的樣品前處理方法，廣泛應(yīng)用于果蔬中的農(nóng)藥多殘留檢測[5]。但串聯(lián)質(zhì)譜法測定水果及蔬菜中多組分農(nóng)殘的相關(guān)標(biāo)準還未正式頒布，因此，定量的仲裁依據(jù)仍為單級質(zhì)譜法[6]。本研究篩選出對蔬菜基質(zhì)凈化效果較好的石墨化炭黑/氨基柱(PC/NH2)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)，建立同時測定蔬菜中77種農(nóng)藥殘留量的分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Scion-TQ液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，BRUKER公司)。Carb/NH2固相萃取柱(500 mg/6mL，杭州富?？萍挤?wù)有限公司),Cleanert PC/NH2固相萃取柱(1 000 mg/6mL,天津博納艾杰爾公司)Pro Elut TPC固相萃取柱(6 mL，迪馬公司)。

PL2005農(nóng)藥混標(biāo)1(51種，日本株式會社)；其余26種農(nóng)藥標(biāo)準品均購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。無水Na2SO4、NaCl(優(yōu)級純，天津科密歐試劑公司)；甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，美國TEDIA公司)。分別吸取77種農(nóng)藥(68種有機磷及9種氨基甲酸酯)標(biāo)準溶液，用丙酮溶解并定容至10 mL，配制成單標(biāo)準溶液，然后吸取不同體積的單個標(biāo)準溶液混勻，配制成混合標(biāo)準溶液，-4 ℃保存。

1.2 樣品制備

稱取20.0000 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，于15 000 r/min勻漿提取1 min，提取兩次后，加入5 g NaCl再勻漿提取1 min，再10 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液20 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL左右，待凈化。在Cleanert PC/NH2柱中加入約2 cm高無水Na2SO4，加樣前先用5 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)預(yù)洗柱后，迅速將樣品溶液轉(zhuǎn)移至凈化柱中，收集洗脫液，氮吹至近干，加入1 mL正己烷，混勻，用于GC-MS測定。

1.3 GC-MS條件

GC條件：Agilent J&W DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣：氦氣，純度≥99.999%；不分流進樣，進樣口溫度：250 ℃。MS條件：電子轟擊離子源(EI)，電離能量：70 eV，分析模式：SIM，離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：280 ℃，恒線速度：44 cm/s，進樣量：1.0 μL。程序升溫條件：起始溫度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至240 ℃保持4 min，最后以10 ℃/min升至280 ℃保持4 min。溶劑延遲時間7.0 min。

表1 77種農(nóng)藥保留時間及質(zhì)譜條件參數(shù)

(續(xù)表1)

No.PesticideRetention time(min)CAS No.Scan time(ms)Quantitative mass(m/z)Qualitative mass(m/z)46Isocarbophos21.3424353-61-51513612112011047Trichloronate21.47327-98-045109297269-48Fosthiazate21.8598886-44-31519916619528349Isofenphos-methyl21.8499675-03-31505812119924150Chlorfenvinfos22.08470-90-61526729532326951Isofenphos22.3725311-71-115213255185-52cis-Chlorfenvinphos22.4218708-87-710026729532326953Phenthoate22.572597-03-71527424632027754Quinalphos22.6313593-03-81514629815715655Methidathion23.09950-37-830014515730212556Propaphos23.247292-16-215220304262-57Tetrachlorvinphos23.3422248-79-91532933133310958Butamifos23.6936335-67-815286200232-59Fenamiphos23.9122224-92-615303288217-60Mocap24.1034643-46-41516230926723961Profenofos24.2641198-08-715339374297-62Fensulfothion25.64115-90-215293292308-63Ethion25.90563-12-215231384199-64Sulprofos26.4335400-43-230156322280-65Triazophos26.46122-14-515161172257-66Famphur26.6352-85-7152181252179367Edifenphos26.8617109-49-830173310201-68Pyridaphenthion28.61119-12-01519918820434069Carbosulfan28.7055285-14-84516011816316470Phosmet28.71732-11-6251601619315971EPN28.992104-64-51515716932318572Anilofos29.0064249-01-0100184226334-73Piperophos29.0924151-93-730140320122-74Phosalone30.412310-17-01512136715418475Azinphos30.486-50-01510416013212576Pyraclofos32.4877458-01-610028336019413877Coumaphos34.0356-72-415362226334109

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑體積及提取次數(shù)優(yōu)化

大多數(shù)的農(nóng)藥殘留檢測的前處理都采用乙腈作為提取溶劑[7 - 8]。本研究在空白蔬菜基質(zhì)中添加各組分濃度為278 μg/mL的混合標(biāo)準溶液1 mL，以乙腈為提取溶劑，分別比較10 mL×2次、20 mL×1次和20 mL×2次的提取效果，結(jié)果以3次的平均值計算，以回收率作為驗證指標(biāo)。結(jié)果顯示當(dāng)提取溶劑為20 mL時，2次提取的回收率較高。

2.2 凈化條件的選擇及優(yōu)化

利用空白蔬菜基質(zhì)探究了不同種類固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果顯示，針對小白菜基質(zhì)經(jīng)Carb/NH2柱(500 mg/6mL)、Cleanert PC/NH2柱(1 000 mg/6mL)及Pro Elut TPC柱(6mL)凈化后的效果較好，能夠去除大部分雜質(zhì)。3種凈化效果較好固相萃取柱的添加回收率結(jié)果顯示，利用PC/NH2柱(1 000 mg/6mL)的凈化效果要優(yōu)于Carb/NH2柱(500 mg/6mL)及TPC柱(6 mL)的凈化效果，77個目標(biāo)組分的添加回收率在60%～120%內(nèi)，可滿足于定量分析的要求。本實驗均以Cleanert PC/NH2柱作為蔬菜及果汁樣品的凈化柱。另外，本研究還考察了淋洗液的體積對回收效率的影響(其他條件不變，淋洗液分別為6、9、12、15、18 mL)，結(jié)果表明當(dāng)淋洗液為12 mL時，各組分的回收率結(jié)果相對較高，且大多數(shù)目標(biāo)組分均未超過100%，所以實驗中用12 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)分三次淋洗。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)對于復(fù)雜基質(zhì)樣品分析非常重要[9]。本研究同時選取兩組分別由溶劑和空白小白菜基質(zhì)溶液配制的混合標(biāo)準工作溶液，GC-MS測定后，繪制標(biāo)準工作曲線，計算基質(zhì)效應(yīng):ME=Y/X×100%。X為純?nèi)軇┲心繕?biāo)物的平均響應(yīng)值，Y為空白樣品基質(zhì)中加入相同含量標(biāo)準品時的平均響應(yīng)值。當(dāng)ME值等于或接近100%時，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)ME值大于100%時，表明存在離子增強作用；當(dāng)ME值小于100%時，表明存在離子抑制作用[10]。在77種目標(biāo)組分中，19種化合物的ME在100%～140%之間，基質(zhì)效應(yīng)明顯增強，因此，本文使用基質(zhì)匹配的標(biāo)準溶液在一定程度上可消除基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)物測定的影響。具體的蔬菜基質(zhì)加標(biāo)(7.58 μg/kg)后的總離子流圖如圖1所示。

圖1 蔬菜基質(zhì)加標(biāo)(7.58 μg/kg)樣品在選擇離子監(jiān)測(SIM)模式下的總離子流(TIC)色譜圖 Fig.1 TIC chromatogram in SIM mode of a vegetable matrix spiked(7.58 μg/kg) sample Note(1-77):The peak mark in the figure corresponded to that in table.

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

配制75.75、151.5、303.0、606.0、909.0 μg/mL的混合標(biāo)準基質(zhì)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。采用標(biāo)準品的保留時間和相對離子豐度比進行定性，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果如表2所示，77種目標(biāo)物的線性關(guān)系良好(R2>0.99)，檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分別為0.0003～0.004、0.001～0.013 mg/kg。

2.5 加標(biāo)回收率

取空白小白菜樣品，分別添加3.79、7.58和30.3 μg/kg的混合標(biāo)準溶液，按優(yōu)化后的條件處理和分析，平行測定6次。結(jié)果顯示，77種化合物加標(biāo)回收率范圍在60.3%～124.5%之間，RSD(n=6)在0.9%～9.1%之間。

表2 77種化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限

(續(xù)表2)

No.PesticideLinear regression equationR 2LOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)21Carbofurany=2861.7524x+501620.99120.0020.00522Simaziney=10738x-581460.99080.0020.00523Cyanophosy=62502x+21463000.99930.0010.00424Fonofosy=62953x+20959000.99840.00030.00125Diazinony=24755x+22226000.99680.0010.00226Disulfotony=27263x-843770.99930.0020.00727Isazophosy=16684x+212880.99830.0030.00928Etrimfosy=24823x-5142.47020.99840.0030.00929Pirimicarby=63565x+954400.99830.0020.00530Phosphamidony=1577.4078x+307110.99630.0020.00631Dichlofenthiony=28210x-1123300.99880.0020.00532Chlorpyrifos-methyly=22709x-830.65650.99980.0020.00533Parathion-methyly=3847.7195x-414650.99810.0020.00534Tolclofos-methyly=65640x-191270.99910.0010.00435Alachlory=20890x-323870.99930.0030.01036Fenchlorphosy=22980x-154490.99960.0020.00737Pirimiphos-methyly=19610x-692540.99930.0020.00538Fenitrothiony=5133.9868x-106230.99760.0020.00639Phorate sulfoxidey=45079x-32462000.99970.0000.00140Malathiony=9034.7246x-1285800.99750.0020.00541Phorate sulfoney=27438x-3426400.99920.0030.01042Clorpyrifosy=9373.3750x-834370.99980.0020.00643Fenthiony=35230x-2088700.99980.0020.00544Parathiony=3249.9412x-637560.99500.0020.00745Mirexy=120.5001x-165930.99080.0030.00846Isocarbophosy=2633.1538x-3695400.99380.0020.00547Trichloronatey=4791.4556x+2995500.99230.0020.00648Fosthiazatey=34173x-3525100.99960.0010.00349Isofenphos-methyly=24888x+3145900.99880.0030.00850Chlorfenvinfosy=15879x-1932100.99880.0020.00751Isofenphosy=23223x-2884400.99960.0020.00552cis-Chlorfenvinphosy=14211x-984040.99890.0030.00853Phenthoatey=13306x-3080900.99950.0030.01054Quinalphosy=20800x-170670.99960.0020.00555Methidathiony=9200.8623x+1647000.99250.0010.00456Propaphosy=29423x-5733900.99550.0010.00357Tetrachlorvinphosy=3347.3740x-296090.99200.0040.01158Butamifosy=6485.7856x-1028200.99580.0040.01259Fenamiphosy=4643.6235x-882720.99020.0020.00660Mocapy=1.1448x-186110.99960.0030.00961Profenofosy=2113.6936x-305690.99690.0020.00562Fensulfothiony=4761.3125x-408010.99810.0030.00863Ethiony=21597x-5981700.99700.0020.00764Sulprofosy=10781x-2675900.99830.0020.00665Triazophosy=4911.1753x-916700.99440.0020.00566Famphury=5842.0264x-6953.24950.99600.0040.01167Edifenphosy=966.6445x+2.71870.99570.0020.00768Pyridaphenthiony=2510.8672x-426100.99400.0030.00869Carbosulfany=6062.8892x+467960.99900.0030.01070Phosmety=4697.8174x-1513500.99660.0020.00571EPNy=7659.2324x-1.514700.99720.0020.00772Anilofosy=6354.2740x-236560.99200.0020.00773Piperophosy=5341.0903x-1215800.99730.0020.00774Phosaloney=1425.2905x+500510.99420.0030.00890Azinphosy=16661x-4743200.99480.0020.00776Pyraclofosy=91.9160x+2306800.99300.0030.00877Coumaphosy=180.7940x-141580.99240.0030.008

*Y：peak area of target compound；X： mass concentration of target compound,μg/L.

2.6 實際樣品分析

采用本研究建立的方法對2017年貴州省食品風(fēng)險監(jiān)測所送檢的的60份樣品進行監(jiān)測，在1份蔬菜樣品中檢出毒死蜱農(nóng)藥，其含量為為20.05 μg/kg，超過食品風(fēng)險監(jiān)測評估種的限值要求。

3 結(jié)論

本研究比較了農(nóng)藥殘留分析中常用的固相萃取柱的凈化效果，篩選出對蔬菜基質(zhì)凈化效果較好的固相萃取柱，建立了結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法同時測定蔬菜中77種農(nóng)藥殘留量的方法。該方法前處理步驟簡便，特異性強，回收率穩(wěn)定，適合蔬菜及水果基質(zhì)中多組分農(nóng)藥殘留的篩查和確證。