沈愛軍，張旭南，李永勇，馮 峰，張建泉，王培軍*

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院影像科，上海 200065；2.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院影像科，江蘇 南通 226361；3.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程與納米科學(xué)研究院，上海 200092)

在我國(guó)，肺癌的發(fā)生率和致死率高居惡性腫瘤首位[1]，早期、精準(zhǔn)診斷以及準(zhǔn)確評(píng)估肺癌惡性程度和轉(zhuǎn)移可能性，對(duì)于降低患者死亡風(fēng)險(xiǎn)、改善預(yù)后具有重要意義。整合素家族中的αvβ3亞型在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中呈高表達(dá)，并與腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力相關(guān)[2-4]。通過檢測(cè)肺癌組織中整合素αvβ3的表達(dá)情況，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌的精準(zhǔn)診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。但是，目前檢測(cè)肺癌組織中整合素αvβ3的表達(dá)基本依賴于組織學(xué)方法，須手術(shù)或活檢后才能獲得結(jié)果。分子影像學(xué)的興起，特別是各種新型納米分子成像探針的研發(fā)，為無(wú)創(chuàng)評(píng)價(jià)肺癌組織中整合素αvβ3的表達(dá)提供了可能[5]。本研究旨在構(gòu)建以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(RGD)為靶向基團(tuán)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)為載體、Gd為成像劑的新型MR納米分子成像探針RGD-Gd@BSA，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討其用于NSCLC精準(zhǔn)診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的可行性。

1 材料與方法

1.1主要材料 BSA(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；RGD[吉爾生化(上海)有限公司]；六水氯化釓 (GdCl3·6H2O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；釓噴酸葡甲胺注射液(Gd-DTPA，北京北陸藥業(yè)股份有限公司)；馬來酰亞胺-聚乙二醇2000-N-羥基琥珀酰亞胺(Mal-PEG2000-NHS，北京鍵凱科技股份有限公司)；N-乙基馬來酰亞胺(NEM，Sigma Aldrich)；二氫卟吩e6(Ce6，F(xiàn)rontier Scientific)；肺腺癌A549細(xì)胞株和人胚腎293T細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)。

1.2分子成像探針RGD-Gd@BSA的合成 將5 ml GdCl3·6H2O溶液(0.4 mg/ml)在磁力攪拌下緩慢滴入10 ml BSA溶液中，得到乳白色溶液，繼續(xù)滴加 5 ml NaOH溶液(0.2 mg/ml)，至溶液澄清后繼續(xù)室溫下攪拌1 h，超速離心(4 500 r/min)下超濾15 min除去未反應(yīng)的Gd3+，得到產(chǎn)物Gd@BSA。調(diào)節(jié)Gd@BSA溶液pH值至7.2，將5 ml NEM溶液 (0.5 mg/ml)緩慢滴入Gd@BSA溶液中，室溫下反應(yīng)2 h，透析去除多余NEM。調(diào)節(jié)pH值至8.0，向溶液中滴加5 ml Mal-PEG2000-NHS溶液(0.6 mg/ml)，繼續(xù)反應(yīng)2 h，透析去除多余Mal-PEG2000-NHS。調(diào)節(jié)pH值至7.0，向溶液中滴加巰基修飾的RGD溶液 5 ml (3 mg/ml)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h，得到產(chǎn)物RGD-Gd@BSA。加入光敏劑Ce6，反應(yīng)后獲得Ce6修飾的RGD-Gd@BSA。

1.3分子成像探針RGD-Gd@BSA的相關(guān)表征 以X線透射電鏡觀察RGD-Gd@BSA的形態(tài)，以納米激光粒度分析儀(型號(hào)NanoZS90)檢測(cè)RGD-Gd@BSA的水合動(dòng)力學(xué)直徑和Zeta電位，觀察24 h內(nèi)RGD-Gd@BSA在不同溶液(去離子水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液及細(xì)胞培養(yǎng)液)中的粒徑變化，評(píng)價(jià)分子探針的溶液分散穩(wěn)定性。配置不同Gd3+濃度(0.15、0.30、0.60、1.20和2.40 μmol/L)的Gd@BSA和RGD-Gd@BSA溶液，以3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT]比色法檢測(cè)含不同Gd3+濃度Gd@BSA和RGD-Gd@BSA溶液中人胚腎293T細(xì)胞的存活率，評(píng)價(jià)納米材料的生物安全性。

配置不同Gd3+濃度(0.022、0.043、0.087、0.173、0.347、0.693 mmol/L)的RGD-Gd@BSA和Gd-DTPA溶液，以體外磁場(chǎng)發(fā)生儀(型號(hào)MFG-1000)分別檢測(cè)不同Gd3+濃度下RGD-Gd@BSA和Gd-DTPA的T1值，將T1值倒數(shù)與相應(yīng)的Gd3+濃度線性擬合，分別得到兩者的T1弛豫率。同時(shí)對(duì)兩者行MR掃描，獲得T1WI。采用Siemens Magnetom Verio 3.0T MR掃描儀，頭頸線圈。掃描參數(shù)：TR 600 ms，TE 15 ms，層厚2 mm，F(xiàn)OV 150 mm×150 mm。

圖1 RGD-Gd@BSA的形貌及尺寸 A.X線透射電鏡圖； B.水合動(dòng)力學(xué)直徑

圖2 RGD-Gd@BSA在不同溶液中的分散穩(wěn)定性 A.去離子水； B.生理鹽水； C.磷酸鹽緩沖液； D.細(xì)胞培養(yǎng)液

1.4A549細(xì)胞靶向性熒光成像 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，接種于6孔板中，細(xì)胞數(shù)3×105個(gè)/孔，于飽和濕度、37℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中孵育24 h，分別加入光敏劑Ce6修飾的RGD-Gd@BSA(靶向組)和Gd@BSA(非靶向組)溶液(Gd3+濃度為 0.6 μmol/L，2 ml/孔)，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)孵育2 h。以磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞2遍，加入4%多聚甲醛，每孔 1 ml，室溫下固定10 min。去除多聚甲醛并以磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞后，每孔加入0.5 ml DAPI溶液室溫避光染色5 min。去除DAPI并以磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞，滴加抗熒光淬滅封片劑，密封避光保存。熒光共聚焦顯微鏡下分別行細(xì)胞成像(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，接收630 nm)。

1.5A549細(xì)胞靶向MRI 細(xì)胞接種培養(yǎng)同熒光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)，孵育24 h后分別加入RGD-Gd@BSA(靶向組)和Gd@BSA(非靶向組)溶液，每組2個(gè)Gd3+濃度梯度(0.050和0.025 mmol/L)，繼續(xù)孵育1.5 h。以磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞、胰酶消化、離心，所得細(xì)胞團(tuán)以磷酸鹽緩沖液制成細(xì)胞懸液，分別置入2 ml EP管內(nèi)，獲取MR T1WI，參數(shù)同前；勾畫ROI，測(cè)量其T1WI相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組間T1WI信號(hào)強(qiáng)度的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RGD-Gd@BSA的表征 X線透射電鏡顯示RGD-Gd@BSA呈類球形，形貌均一，平均水合動(dòng)力學(xué)直徑為(99.52±2.62)nm(圖1)；Zeta電位為(-11.07±0.42)mV。在去離子水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液及細(xì)胞培養(yǎng)液4種不同溶液中，RGD-Gd@BSA分散穩(wěn)定，連續(xù)觀察24 h，RGD-Gd@BSA的水合動(dòng)力學(xué)直徑變化幅度分別為37.46%、14.62%、25.10%和21.24%(圖2)。體外水溶液MRI顯示，各濃度RGD-Gd@BSA溶液的T1WI信號(hào)強(qiáng)度均高于Gd-DTPA(圖3A)，RGD-Gd@BSA弛豫率為18.615 L/(mmol·s)，而Gd-DTPA為3.404 L/(mmol·s)；見圖3B。

2.2細(xì)胞毒性試驗(yàn) 隨Gd3+濃度增加，Gd@BSA和RGD-Gd@BSA對(duì)293T細(xì)胞均表現(xiàn)出較好的生物相容性，在Gd3+濃度為0.15、0.30、0.60、1.20和2.40 μmol/L的納米探針溶液中，人胚腎293T細(xì)胞的存活率分別為：Gd@BSA，81.42%、77.90%、81.44%、77.32%和67.43%；RGD-Gd@BSA，81.74%、86.80%、69.83%、78.41%和66.95%(圖4)。

圖3 不同Gd3+濃度RGD-Gd@BSA及Gd-DTPA溶液體外MR成像效果 A.T1WI； B.T1弛豫率擬合圖

圖4 不同Gd3+濃度Gd@BSA和RGD-Gd@BSA下人胚腎293T細(xì)胞的存活率柱形圖

2.3A549細(xì)胞靶向性熒光成像 熒光共聚焦顯微鏡下，Gd@BSA和RGD-Gd@BSA均能被人肺腺癌A549細(xì)胞吞噬攝取，對(duì)RGD-Gd@BSA的攝取多于Gd@BSA，產(chǎn)生更高的熒光強(qiáng)度(圖5)。

2.4A549細(xì)胞靶向MRI Gd3+濃度為0.050 mmol/L和0.025 mmol/L時(shí)，靶向組(RGD-Gd@BSA)細(xì)胞懸液T1WI相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度均高于非靶向組(Gd@BSA)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.907、2.845，P=0.017、0.047，圖6)。

3 討論

在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率和死亡率急劇上升，已居惡性腫瘤之首。在組織學(xué)分型上，NSCLC占肺癌的85%以上[6]。臨床約80%肺癌患者確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，50%患者在初次確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移[7]。因此，早期、精準(zhǔn)診斷和準(zhǔn)確判斷預(yù)后，對(duì)于肺癌患者治療方案選擇和提高療效具有重要意義。影像學(xué)，特別是CT、MRI的廣泛應(yīng)用和不斷發(fā)展，極大地提高了肺癌患者病灶的檢出率，然而在腫瘤病灶定性診斷的準(zhǔn)確率以及對(duì)早期小病灶空間定位的敏感度方面，常規(guī)影像學(xué)檢查技術(shù)還有一定局限性。

圖5 分子成像探針靶向肺腺癌A549細(xì)胞熒光共聚焦成像(×40) A～C.靶向組(RGD-Gd@BSA)； D～F.非靶向組(Gd@BSA) (DAPI：細(xì)胞核熒光染料，呈藍(lán)色熒光；Ce6：染色探針，呈綠色熒光；Merged：二者融合圖像)

圖6 人肺腺癌A549細(xì)胞不同Gd3+濃度下T1WI和相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度柱形圖 A.靶向組T1WI； B.非靶向組T1WI； C.T1WI相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度柱形圖(*：P<0.05)

分子影像學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，提高了影像醫(yī)學(xué)對(duì)腫瘤的診斷效能。惡性腫瘤診斷效能主要包括敏感度和特異度兩個(gè)方面，而基于納米技術(shù)的各類新型分子成像探針的研發(fā)能夠同時(shí)提升敏感度和特異度[8]?；贛RI的分子探針研發(fā)成為分子影像學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，而選擇合適靶點(diǎn)是構(gòu)建腫瘤特異性MR分子成像探針的關(guān)鍵。研究[2,9-10]表明，整合素αvβ3在NSCLC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并與腫瘤分化程度、病理分期、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；且整合素αvβ3能特異性識(shí)別含RGD的配體，并通過配體-受體結(jié)合的方式調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)行為[11]。因此，本研究以整合素αvβ3為靶點(diǎn)，RGD為靶向基團(tuán)，Gd為成像劑，構(gòu)建MR分子成像探針，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)NSCLC的特異性診斷。

MR分子成像探針在腫瘤區(qū)產(chǎn)生特異性MR信號(hào)的首要條件是探針能夠順利到達(dá)靶組織，然后通過靶向基團(tuán)(配體)與靶點(diǎn)(受體)特異性結(jié)合，使探針在腫瘤內(nèi)特異性富集。機(jī)體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬系統(tǒng)(reticuloendothelial system， RES)或單核巨噬細(xì)胞吞噬系統(tǒng)(mononuclear phagocyte system， MPS)對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的納米顆粒的吞噬清除，是阻礙分子成像探針順利到達(dá)腫瘤靶區(qū)的重要因素。研究[12]表明，納米顆粒粒徑為100～200 nm，可有效減少RES或MPS的吞噬，延長(zhǎng)其在血液循環(huán)中的時(shí)間，進(jìn)而提升納米顆粒進(jìn)入腫瘤組織的有效數(shù)量。本研究制備的分子成像探針RGD-Gd@BSA粒徑為(99.52±2.62)nm，理論上可有效避免RES或MPS的吞噬，保證其到達(dá)腫瘤靶區(qū)的有效數(shù)量。溶液分散穩(wěn)定性亦是決定探針能否順利進(jìn)入腫瘤靶區(qū)的重要因素。本研究以BSA為載體，分子探針表面帶負(fù)電荷[Zeta電位為(-11.07±0.42)mV]，保證其具有很好的溶液分散穩(wěn)定性。

MR分子成像探針在腫瘤區(qū)產(chǎn)生特異性MR信號(hào)的另一個(gè)重要條件是探針本身的T1弛豫能力。對(duì)于以Gd為代表的順磁性MR對(duì)比劑，根據(jù)經(jīng)典的SBM(Slomon-Bloembergen-Morgen)理論[13]，提升其T1弛豫率的方法主要包括：①減慢自旋時(shí)間；②延長(zhǎng)結(jié)合水分子的停留時(shí)間；③增加結(jié)合水分子的數(shù)量。本研究設(shè)計(jì)的分子成像探針RGD-Gd@BSA因存在BSA蛋白載體而分子量較高，能夠有效延長(zhǎng)自旋時(shí)間，且大分子蛋白本身具有一定的對(duì)水分子的束縛作用，故RGD-Gd@BSA具有明顯高于Gd-DTPA對(duì)比劑的弛豫率，以提高其T1成像能力。

為驗(yàn)證RGD-Gd@BSA對(duì)NSCLC的靶向能力，本研究分別進(jìn)行A549細(xì)胞靶向性熒光成像和MRI，通過向BSA疏水區(qū)內(nèi)引入光敏劑Ce6的方法，賦予探針產(chǎn)生熒光的能力。熒光共聚焦顯微鏡下，靶向組A549細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熒光強(qiáng)度高于非靶向組，表明RGD-Gd@BSA對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有更高的親和力。MRI實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，靶向組細(xì)胞懸液的T1WI相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度高于非靶向組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示RGD-Gd@BSA具有NSCLC靶向性MR成像的能力。

總之，本研究設(shè)計(jì)合成的RGD-Gd@BSA具有較好的生物相容性和溶液分散穩(wěn)定性、較高的T1弛豫率和對(duì)肺癌A549細(xì)胞的靶向性，可作為用于NSCLC早期、精準(zhǔn)診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的MR分子成像探針，值得進(jìn)一步研究。