潘教文，李丹，吳建國，李臻，王慶國，管延安，劉煒

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生理生態(tài)重點實驗室，山東 濟南 250100；2.濟南大學醫(yī)學與生命科學學院，山東 濟南 250202；3.山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，山東 濟南 250100)

土壤中高濃度的Na+及Cl-易造成土壤鹽漬化進而產(chǎn)生鹽脅迫，是限制植物生長發(fā)育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要環(huán)境因子之一，也是全球面臨的重大危機之一[1]。鹽脅迫主要表現(xiàn)為離子脅迫、滲透脅迫及過氧化脅迫等造成的次生傷害，可通過破壞細胞的正常離子分布和動態(tài)平衡，干擾植物細胞內(nèi)的各種代謝過程，造成細胞內(nèi)活性氧的過量積累，引起細胞膜脂過氧化和蛋白質(zhì)破壞，最終造成植物的傷害甚至死亡[2]。我國鹽漬化土地主要分布在東北、華北、西北內(nèi)陸地區(qū)以及長江以北沿海地帶[3]。隨著我國經(jīng)濟持續(xù)繁榮發(fā)展、人口數(shù)量逐漸增多，對糧食作物的需求量逐漸增大，糧食安全面臨更加嚴峻的挑戰(zhàn)。充分解析鹽脅迫下植物的信號轉(zhuǎn)導途徑及相關(guān)機制，是進行植物抗鹽分子育種的重要途徑[2, 3]。

植物應(yīng)對鹽脅迫形成了一系列的適應(yīng)機制，其中SOS(salt overly sensitive)信號途徑是植物耐鹽性的重要信號通路，該途徑主要包括SOS1、SOS2、SOS3、SOS4、AKT1、NHX1和HKT1等基因[4, 5]。SOS1對于植物耐鹽性非常重要，它是抗鹽脅迫的關(guān)鍵基因。其編碼細胞膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運體(Na+/H+antiporter)，可以將鹽脅迫下細胞質(zhì)內(nèi)的額外Na+排到胞外。SOS2編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，SOS3編碼Ca2+結(jié)合蛋白[5]。SOS2的N末端有一個催化區(qū)域，C末端有一個調(diào)控區(qū)域，SOS3可與SOS2的調(diào)控區(qū)發(fā)生互作并激活SOS2形成復合體，SOS2-SOS3復合體通過磷酸化作用調(diào)控SOS1的表達，從而在維持細胞質(zhì)鈉鉀離子的穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮作用[2，6，7]。研究指出，SOS2和SOS3復合體的形成對于調(diào)控SOS1的活性具有重要作用，其在SOS途徑中也具有重要地位。在擬南芥中過量表達AtSOS1顯著增加轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性；將酵母質(zhì)膜Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白基因SOS2在擬南芥和水稻中過量表達也同樣提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性；同時在擬南芥中過表達AtSOS1、AtSOS2和AtSOS3，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性比只表達其中一個基因有更加明顯的提高，進一步證明SOS1依賴SOS2和SOS3的調(diào)節(jié)以介導Na+外排及其對植物耐鹽性的重要作用[8]。

熒光素酶互補技術(shù)(firefly luciferase complementation imaging assay, LCI)是近年來形成的研究體內(nèi)蛋白互作的技術(shù)。該技術(shù)是將熒光素酶(luciferase，LUC)分成N端部分(nLUC)和C端部分(cLUC), 它們不能自發(fā)重組發(fā)揮作用, 但當它們分別融合兩個能夠互作的蛋白時, 則能引發(fā)重組的熒光素酶活性。以含有不同LUC片段的植物表達載體，借助于煙草瞬時表達系統(tǒng)，在研究植物蛋白的相互作用中，可以實現(xiàn)活體細胞內(nèi)實時、定量分析[9]。pCAMBIA1300-cLUC和pCAMBIA1300-nLUC載體圖譜如圖1。

本研究參照來源于不同物種的SOS2及SOS3同源基因設(shè)計特異引物，對谷子中SOS2和SOS3基因SiPKS32(XP_004978441)、SiCaBP5(XP_004969073)進行克隆，并進一步構(gòu)建SiPKS32、SiCaBP5基因的cLUC、nLUC融合表達載體，以農(nóng)桿菌介導共侵染煙草幼苗葉片，觀察熒光信號情況，以期揭示SiPKS32與SiCaBP5的互作情況，探索谷子中是否存在SOS信號轉(zhuǎn)導途徑。對谷子中SOS基因家族作用機制的研究，將為進一步利用基因工程手段培育抗逆作物新品種奠定基礎(chǔ)。

圖1 pCAMBIA1300-cLUC、pCAMBIA1300-nLUC載體圖譜

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷子“豫谷1號”培養(yǎng)至三葉期備用。本氏煙(NicotianabenthamianaL.)播種于含有蛭石的營養(yǎng)土中，置于23℃下、光周期為8 h光照/16 h黑暗的人工氣候室中，培養(yǎng)至葉片直徑約2～3 cm時備用。

大腸桿菌(Escherichiacoil)TransDH5α、Blunt3克隆載體購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；pCAMBIA1300-cLUC、pCAMBIA1300-nLUC植物表達載體由山東農(nóng)業(yè)大學葛磊教授提供；農(nóng)桿菌GV3101由本實驗室保存。引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成；測序由山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心完成。

1.2 SiPKS32、SiCaBP5基因的克隆

以谷子幼苗為材料，參照TransZol Plant試劑盒說明書提取總RNA，并參照PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書對所提RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到單鏈cDNA。根據(jù)不同物種中SOS2、SOS3基因同源序列信息及KpnⅠ、SalⅠ酶切位點，設(shè)計SiCaBP5特異性引物，SiCaBP5-S：AGGTACCATGGGGTGCATACCAACAAAG(下劃線為KpnⅠ 酶切位點)，SiCaBP5-A：AGTCGACCATTTCAGGTTTGGCAGC(下劃線為SalⅠ酶切位點)。SiPKS32特異性引物，SiPKS32-S： AGGTACCATGAGTACAACCAAGGTGAAGA(下劃線為KpnⅠ酶切位點)，SiPKS32-A：AGTCGACCTAAGCAGCAGGTTGCATCG(下劃線為SalⅠ酶切位點)。經(jīng)94℃下5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min, 獲得谷子中的SOS2同源基因序列SiPKS32(XP_004978441)，SOS3同源基因序列SiCaBP5(XP_004969073)，將基因片段連接到克隆載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，送公司測序。

1.3 含有N端及C端LUC片段的SiPKS32、SiCaBP5互補表達載體的構(gòu)建

將克隆測序正確的SiPKS32、SiCaBP5基因序列與pCAMBIA1300-cLUC、pCAMBIA1300-nLUC載體分別進行KpnⅠ、SalⅠ雙酶切，酶切片段經(jīng)T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，進行陽性重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-SiPKS32-cLUC、pCAMBIA1300-SiCaBP5-nLUC的鑒定。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進一步轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

1.4 熒光素酶互補試驗

選取葉色濃綠、生長旺盛的本氏煙葉片用作煙草瞬時表達系統(tǒng)的材料。將含有不同重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101培養(yǎng)至穩(wěn)定期，5 000 r/min離心10～15 min，先用3 mL左右的懸浮液懸浮，測OD600值，然后用懸浮液把OD600統(tǒng)一調(diào)至1，靜置3 h。將煙草葉片分為四個區(qū)域，分別注射不同的菌懸液組合，試驗組：pCAMBIA1300-SiPKS32-cLUC和pCAMBIA1300-SiCaBP5-nLUC；對照組1：pCAMBIA1300-SiPKS32-cLUC和pCAMBIA1300-nLUC；對照組2：pCAMBIA1300-SiCaBP5-nLUC和pCAMBIA1300-cLUC；陰性對照組：pCAMBIA1300-nLUC和pCAMBIA1300-cLUC。

注射后的煙草葉片在光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 d，之后在相同的注射部位注射熒光素酶底物D-熒光素鉀鹽溶液，注射面積需大于菌液注射面積，于黑暗中靜置5 min，將葉片取下，背面向上，置于活體成像系統(tǒng)中，利用CCD相機檢測熒光信號，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiPKS32、SiCaBP5基因序列分析

利用擬南芥SOS2(NM_122932)和SOS3(NM_001203448)蛋白序列在NCBI中進行BLAST檢索分析，分別找到谷子中同源基因SiPKS32(XP_004978441)和SiCaBP5(XP_004969073)，通過設(shè)計特異引物序列進行PCR克隆后測序分析。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，SiPKS32與AtSOS2的相似性為56%，在N端含有保守的激酶區(qū)(圖2)，而且含有保守的SOS3結(jié)合區(qū)序列FISL motif。SiCaBP5與AtSOS3的相似性為51.88%，含有3個保守的EF hand Ca2+結(jié)合位點(圖3)。

2.2 SiPKS32-cLUC、SiCaBP5-nLUC互補表達載體的構(gòu)建

將測序正確的SiPSK32和SiCaBP5序列經(jīng)KpnⅠ、SalⅠ雙酶切，分別與cLUC、nLUC載體片段連接，獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-SiPKS32-cLUC、pCAMBIA1300-SiCaBP5-nLUC，利用雙酶切對質(zhì)粒進行鑒定, 鑒定結(jié)果如圖4，酶切后的片段大小與SiPKS32和SiCaBP5基因大小一致，條帶清晰，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

AtSOS2(NM_122932)；PKS6(AF339147)；PKS7(AF339148)；PKS8(AF339149)；SiPKS32(XP_004978441)。圖中劃線處為FISL motif區(qū)。

AtSOS3(NM_001203448)；SCaBP5(NP_567533.1)；SCaBP6(NP_194387.1)；SiCaBP5(XP_004969073)。圖中劃線處為EF hand Ca2+結(jié)合位點。

M：DNA Maker，由上到下依次為5000、3000、2000、1000、750、500、200 bp和100 bp；1、2為pCAMBIA1300-SiPKS32-cLUC的酶切片段；3、4為pCAMBIA1300-SiCaBP5-nLUC的酶切片段。

2.3 熒光素酶互補法對SiPKS32/SiCaBP5互作檢測

將上述鑒定為陽性的SiPKS32-cLUC、SiCaBP5-nLUC重組質(zhì)粒進一步重轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101中。應(yīng)用LCI方法，對SiPKS32和SiCaBP5在體內(nèi)的互作情況進行檢測。結(jié)果(圖5)顯示，含有SiPKS32-cLUC、SiCaBP5-nLUC重組質(zhì)粒的菌液共轉(zhuǎn)化煙草葉片后，可檢測到熒光信號，而陰性及對照組熒光信號較弱或無信號，說明這兩個蛋白在植物體內(nèi)可以發(fā)生互作。

3 討論與結(jié)論

土壤鹽漬化已經(jīng)成為全球面臨的重大危機之一，它可以導致土地荒漠化、耕地退化等問題，給農(nóng)作物生產(chǎn)帶來了嚴重的負面影響。近年來，研究人員通過克隆基因和遺傳轉(zhuǎn)化等方法找到了參與植物抗鹽脅迫的一些重要途徑及相關(guān)基因，并構(gòu)建了一些調(diào)控機制模型，例如活性氧清除、離子區(qū)域化、滲透調(diào)節(jié)等。其中鹽脅迫信號的感知及傳遞是植物響應(yīng)鹽害及抗鹽的重要過程。SOS信號通路即為該過程中的關(guān)鍵組分。擬南芥中SOS信號通路的研究相對深入，近年來，根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(如NCBI、TAIR、NASC)中大量的擬南芥表達譜芯片數(shù)據(jù)，通過對鹽脅迫下SOS途徑響應(yīng)基因表達和蛋白質(zhì)互作信息的整合, 已構(gòu)建了SOS途徑特異表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[4]。在水稻[10]、油菜[11]等研究中，也有關(guān)于SOS信號通路的報道。谷子近年來作為新興禾本科植物的模式作物，其突出的抗旱耐瘠特性，已越來越受研究者的關(guān)注。谷子如何參與逆境響應(yīng)，抗逆過程中是否也存在SOS信號途徑，是否也存在通路組分SOS2、SOS3，它們之間是否有互作等問題也亟待解決。

左側(cè)為不同區(qū)域菌液組合示意圖，右側(cè)為熒光圖。

參照擬南芥中的研究進展，在谷子基因組中檢索到部分SOS2、SOS3類基因的同源序列。經(jīng)同源克隆進一步對PCR產(chǎn)物進行測序及序列分析，結(jié)果顯示谷子中獲得的SiPKS32、SiCaBP5基因分別屬于SOS2、SOS3類基因，含有SOS2和SOS3保守的結(jié)構(gòu)域。初步顯示谷子中存在SOS信號通路。已知SOS2和SOS3復合體的形成，可進一步激活SOS1的活性，從而使SOS通路參與植物抗逆過程[12]。為了進一步檢驗谷子中SiPKS32、SiCaBP5是否也存在互作進而形成復合物，以便深入解析基因功能，本研究應(yīng)用LCI法對其進行了檢測。LCI法不受植物自發(fā)熒光的干擾，且操作簡單，不需要裂解細胞提取蛋白質(zhì)，可以很好地反映植物生理條件下蛋白的互作狀態(tài)。當含有SiPKS32基因的cLUC與含有SiCaBP5基因的nLUC由于基因的互作而結(jié)合后，就會表達出完整的熒光素酶，作用于熒光素酶底物從而檢測到熒光信號。本研究結(jié)果顯示含有SiPKS32與SiCaBP5的菌液組合共侵染的煙草葉片可檢測到熒光信號，而僅含有空載體的組合或一個帶有基因的載體與一個空載體的組合均不能使侵染后的葉片產(chǎn)生熒光信號，說明蛋白間存在互作。SOS信號途徑中，除了SOS2、SOS3，還包含SOS1、SOS4、AKT1、NHX1和HKT1等組分[5, 13]。目前也已在谷子中分離并鑒定了SOS1類基因，對其余各組分的鑒定及功能分析工作也正在開展，將為全面驗證及解析谷子中SOS通路及其作用機制、培育谷子抗逆新品種提供依據(jù)。