張麗紅，鄧子淳，方 佳，李蘭洲，劉 艷*

（1. 吉林大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130021；2. 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012）

痛風(fēng)是一種常見的代謝相關(guān)的關(guān)節(jié)炎疾病，高尿酸血癥通常被認(rèn)為是痛風(fēng)發(fā)生的重要生理基礎(chǔ)?？雇达L(fēng)藥物主要可分為兩類，一類是抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎藥物[1]，另一類是抗高尿酸血癥藥物[2]。但是目前市場(chǎng)上的藥物效果單一且均具有不同程度的不良反應(yīng)[3-4]。

異落新婦苷（isoastilbin，IA）是一種二氫黃酮醇苷類化合物，研究證明IA在抗氧化方面顯示有較好效果[5]。IA在土茯苓、黃芪等中藥中廣泛分布[6-7]，已有研究顯示，土茯苓在抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和抗高尿酸血癥方面均顯示出了較好的效果[8-9]。

本文建立了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型和高尿酸血癥小鼠模型，通過對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹變化，炎癥因子水平變化及小鼠血尿酸水平和黃嘌呤氧化酶活性變化，對(duì)異落新婦苷的抗痛風(fēng)活性進(jìn)行研究，并對(duì)異落新婦苷抗痛風(fēng)機(jī)制進(jìn)行討論。

1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性昆明小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購自長(zhǎng)春生物制品研究所，許可證號(hào)：SCXK-（吉）2014-0005；雄性SD大鼠，質(zhì)量180～200 g，購自長(zhǎng)春生物制品研究所，許可證號(hào)：SCXK-（吉）2016-0003。異落新婦苷（IA）和大鼠IL-1β，IL-8，IL-10，MCP-1，IFN-γ，6-Keto-PGF1α，小鼠ROS，SOD，MDA等ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；尿酸UA試劑盒和黃嘌呤氧化酶XOD試劑盒（南京建成生物工程研究所）；多聚甲醛，二甲苯，切片石蠟，鹽酸，無水乙醇和甲酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；尿酸鈉，氧嗪酸鉀（SIGMA集團(tuán)）；秋水仙堿片（云南植物藥業(yè)有限公司）；別嘌呤醇片（世貿(mào)天階制藥（江蘇）有限責(zé)任公司）；蘇木精，水溶性伊紅Y（阿拉丁試劑）。BS224S電子天平（德國Sartorius公司）；可調(diào)式微量移液器（德國eppendorf公司）；BD326電冰箱（中國青島海爾公司）；5810R高速冷凍離心機(jī)（德國 Eppendorf公司）；SYNEK GY4型酶標(biāo)儀（美國伯騰公司）；IX71熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

2 方法

2.1 異落新婦苷抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎活性研究

2.1.1 大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型建立及異落新婦苷治療 50只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，陽性組，15、45 μg/kg異落新婦苷組，每組10只。陽性組灌胃給藥0.3 mg/（kg·d）的秋水仙堿（按照人體劑量換算），異落新婦苷給藥組分別灌胃給藥相應(yīng)劑量的異落新婦苷，其余組給予等體積的雙蒸水，給藥周期為7 d。在第5天給藥1 h后，除空白組大鼠，均進(jìn)行右踝關(guān)節(jié)腔注射100 μL的30 mg/mL尿酸鈉（MSU）懸液，空白組大鼠注射等量生理鹽水。第7天給藥1 h后立刻收集大鼠血清（- 80 ℃保存）和右踝關(guān)節(jié)組織（4%多聚甲醛固定，室溫保存）備用。

2.1.2 大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹變化測(cè)定 繩縛法測(cè)量各組大鼠MSU注射后0、4、12、24 h和48 h右踝關(guān)節(jié)的周長(zhǎng)。計(jì)算其腫脹度，計(jì)算方式如下：

其中，Ct為不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，C0為0 h的大鼠關(guān)節(jié)周長(zhǎng)。

2.1.3 炎癥相關(guān)因子測(cè)定 大鼠炎癥因子IL-1β，IL-8，IL-10，MCP-1，IFN-γ，6-Keto-PGF1α 含量測(cè)定，取大鼠血清按照上海源葉生物科技有限公司ELISA檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.4 大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色切片制備和觀察 大鼠踝關(guān)節(jié)經(jīng)脫鈣，石蠟切片后依次進(jìn)行常規(guī)脫蠟復(fù)水，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，伊紅染色2 min，自來水沖洗，乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明1 min，最后用中性樹膠進(jìn)行封片并加蓋蓋玻片。待樹膠完全干后在顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2.2 異落新婦苷抗高尿酸血癥活性研究

2.2.1 小鼠高尿酸血癥模型建立及異落新婦苷治療 50只雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽性組、15、45 μg/kg 異落新婦苷組，每組10只。陽性組灌胃給藥20 mg/（kg·d）的別嘌呤醇（按照人體劑量換算），異落新婦苷給藥組分別灌胃給藥相應(yīng)劑量異落新婦苷，其余組給予等體積的雙蒸水，為期7 d。在第5～7天給藥1 h后，除空白組外，腹腔注射氧嗪酸鉀溶液300 mg/（kg·d），空白組小鼠注射等量生理鹽水。末次給藥1 h后立刻收集小鼠血清和肝臟（- 80 ℃保存）。

2.2.2 小鼠血清UA測(cè)定 利用南京建成生物工程研究所的尿酸（UA）測(cè)試盒（酶比色法）（微板法）測(cè)定各組小鼠血清中尿酸含量，評(píng)價(jià)異落新婦苷降血尿酸能力。

2.2.3 小鼠XOD活性測(cè)定 小鼠肝臟加入9倍生理鹽水，進(jìn)行機(jī)械勻漿，10 000 r/min離心2次，每次5 min取上清得肝臟勻漿。利用南京建成生物工程研究所的黃嘌呤氧化酶（XOD）測(cè)試盒（比色法）測(cè)定各組小鼠肝臟和血清中XOD活性，評(píng)價(jià)異落新婦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠體內(nèi)XOD活性的影響。

2.3 數(shù)據(jù)處理和分析 選用SPSS 19.00 軟件采用ANOVA分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 異落新婦苷對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響 如圖1所示，在MSU注射建模4、12、24 h和48 h后，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度均顯著增加（P＜0.01），分別增加18.4%，24.5%，24.2%和19.9%，0.3 mg/kg秋水仙堿治療，在4 h和12 h顯示出抑制MSU引起的腫脹（P＜ 0.05），在其他測(cè)定時(shí)間點(diǎn)緩解腫脹效果不明顯。在4、12、48 h時(shí)間點(diǎn)，兩個(gè)劑量的異落新婦苷均顯示出顯著的緩解大鼠關(guān)節(jié)腫漲（P＜0.01）的效果，且效果均在5.7%以上。

圖 1 IA對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響

3.2 異落新婦苷對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥因子的影響 如圖2所示，MSU注射顯著（P＜0.05）提高了大鼠血清中促炎因子IL-8，MCP-1和6-Keto-PGF1α的水平10.8%，9.67%，19.8%，降低了抗炎因子IL-10水平11.2%。MSU引起大鼠關(guān)節(jié)腫脹的過程中同時(shí)引起了大鼠炎癥水平的顯著升高。45 μg/kg異落新婦苷治療后，顯著提高了大鼠IL-10的水平8.7%（P＜0.05），并降低了 IL-1β，IL-8，MCP-1，IFN-γ 7.0% 以上（P＜0.05）。15 μg/kg異落新婦苷的治療僅顯著降低了大鼠血清中IL-8的水平（P＜0.05）。

3.3 異落新婦苷對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的影響 如圖3所示，200倍顯微鏡進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)，MSU注射不會(huì)引起大鼠踝關(guān)節(jié)骨表面損傷，說明關(guān)節(jié)腫脹和炎癥因子升高的原因不是機(jī)械性骨損傷造成的。與空白組相比，模型組大鼠切片中出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，分析其可能是由于炎癥而引起的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組相比，秋水仙堿給藥大鼠的關(guān)節(jié)細(xì)胞浸潤有適當(dāng)緩解。相似地給予異落新婦苷治療細(xì)胞浸潤同樣得到緩解，從組織病理學(xué)角度看異落新婦苷有助于緩解MSU引起的大鼠關(guān)節(jié)處炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，證明異落新婦苷給藥有助于緩解MSU引起的炎癥反應(yīng)過程。

圖 2 IA對(duì)大鼠炎癥因子的影響

3.4 異落新婦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠血尿酸的影響 如圖4所示，氧嗪酸鉀作用后小鼠血清尿酸水平顯著升高了87.6%（P＜0.01），成功模擬高尿酸血癥。別嘌呤醇治療有效的將小鼠血尿酸水平降低到空白組小鼠的水平，異落新婦苷給藥后高尿酸血癥小鼠血清中尿酸含量顯著降低25.8%以上（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。可知異落新婦苷具有與別嘌呤醇相似的降低血尿酸的活性。

3.5 異落新婦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠XOD的影響 如圖5所示，經(jīng)氧嗪酸鉀建模的小鼠肝臟中XOD活性顯著性升高32.5% （P＜0.05），雖然血清中XOD同樣升高了13.2%，但是無顯著性（P＞0.05）。別嘌呤醇治療顯著的降低了高尿酸血癥小鼠血清和肝臟中黃嘌呤氧化酶活性29.8%以上（P＜0.05），異落新婦苷給藥顯著的降低了高尿酸小鼠肝臟中黃嘌呤氧化酶活性12.9%以上（P＜0.05）?？芍惵湫聥D苷與別嘌呤醇相似，可以通過降低小鼠黃嘌呤氧化酶活性從而降低血尿酸水平。

圖 3 IA對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響（200×）

圖 4 IA對(duì)小鼠血尿酸的影響

圖 5 IA對(duì)小鼠XOD活性的影響

4 討論

痛風(fēng)，又稱為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，發(fā)病基礎(chǔ)為巨噬細(xì)胞吞噬尿酸鈉晶體，引起的炎癥級(jí)聯(lián)放大并引起痛覺過敏。痛風(fēng)患者往往在末端關(guān)節(jié)處形成痛風(fēng)石，并形成周期性的關(guān)節(jié)炎發(fā)作[10]。目前針對(duì)痛風(fēng)治療的手段很是有限，病人往往只能通過控制飲食，使用抗炎藥物、降尿酸藥物進(jìn)行痛風(fēng)控制，往往會(huì)出現(xiàn)痛風(fēng)反復(fù)發(fā)作，并深受藥物不良反應(yīng)影響。且目前臨床上的抗痛風(fēng)藥物效果單一，還沒有能同時(shí)控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和高尿酸血癥的安全藥物。所以開發(fā)具有兩種效用且安全的天然化合物受到了許多研究者的關(guān)注[11]。異落新婦苷作為土茯苓等多種中藥中廣泛存在的類黃酮物質(zhì)，其抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎活性和抗高尿酸血癥活性值得期待。

有研究指出，IL-1β是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要炎癥因子，抑制IL-1β可能是治療痛風(fēng)的一種可行策略[12]；IL-8具有促進(jìn)炎癥細(xì)胞募集的作用[13]；MCP-1具有誘導(dǎo)趨化性單核細(xì)胞的能力，在關(guān)節(jié)炎中起重要作用[14]。相反，IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和抑制巨噬細(xì)胞活化中起重要的作用[15-16]。異落新婦苷治療在緩解MSU引起的關(guān)節(jié)腫大方面效果顯著（P＜0.01），并顯著的降低了IL-1β，IL-8，MCP-1，IFN-γ的水平7.0%以上，提高了IL-10水平8.7%。說明了異落新婦苷可以通過調(diào)節(jié)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥因子，緩解痛風(fēng)引起的關(guān)節(jié)腫脹。

一般認(rèn)為高尿酸血癥可能與痛風(fēng)密切相關(guān)，尿酸代謝在急慢性痛風(fēng)發(fā)病中起著關(guān)鍵性作用。直接催化UA產(chǎn)生的XOD的上調(diào)和UA代謝所必需的尿酸氧化酶的缺乏，可導(dǎo)致高尿酸血癥[17]。XOD在UA生產(chǎn)中起著關(guān)鍵的催化作用[18]。異落新婦苷治療在降低血尿酸方面顯示出了較好效果，45 μg/kg異落新婦苷給藥降低血尿酸的效果與別嘌呤醇效果相似，血尿酸水平接近正常小鼠水平。但異落新婦苷給藥僅在肝臟中顯示出了顯著降低XOD活性的效果。推測(cè)異落新婦苷可以通過抑制XOD活性降低高尿酸血癥小鼠血尿酸的水平。