霍麗妮，陳 睿，鐘振國*，李培源，盧澄生

(1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510006；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧 530001)

苦丁茶(IlexKudingchaC.J.Tsing)是冬青科冬青屬苦丁茶種常綠喬木，俗稱菠蘿樹、大葉茶和茶丁等，是我國南部及西南部民間傳統(tǒng)的藥用植物，具有清熱解毒、殺菌消炎、健胃消積、止咳化痰、生津止渴、提神醒腦、明目益智和抗輻射、抗衰老、活血脈、調節(jié)血脂等功效[1]，素有“保健茶”“美容茶”“減肥茶”“降壓茶”“益壽茶”等美稱，可作為新型保健藥開發(fā)，具有很廣闊的前景?？喽〔杌瘜W成分較復雜，主要含有三萜及苷類、黃酮類、多酚類、氨基酸、揮發(fā)油以及多糖等多種有效物質成分[2]。因中草藥具有多成分、多靶點及相互協(xié)同等特點，導致研究苦丁茶活性成分及潛在的藥用靶點存在很大困難。

2007年Hopkins提出網(wǎng)絡藥理學理論[3]，它是基于系統(tǒng)生物學的理論，對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡分析，選取特定信號節(jié)點(Nodes)進行多靶點藥物分子設計的新學科。網(wǎng)絡藥理學強調藥物也可以是多成分-多靶標-多疾病的作用方式，通過對信號通路的多途徑調節(jié)，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，從而提高新藥臨床試驗的成功率，節(jié)省藥物的研發(fā)費用。目前，已有學者將網(wǎng)絡藥理學用于預測和辨識中藥活性成分群、作用靶點及闡明作用機制[4]。因此，筆者基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，運用網(wǎng)絡藥理學方法，建立藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡，結合基因本體GO(gene ontology)和生物通路(pathway)功能富集分析，對活性成分的作用靶點、相關疾病以及生物通路等進行綜合分析，以期揭示苦丁茶的主要活性成分及其藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1化學成分收集與活性成分篩選采用TCMSP數(shù)據(jù)庫，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集苦丁茶的化學成分，共收集苦丁茶化學成分94個。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-like，DL)評價成分的體內過程，選擇OB≥28%和DL≥0.18 作為篩選條件，篩選活性成分。

1.2活性成分與靶點的作用數(shù)據(jù)收集根據(jù)篩選得出的活性成分在TCMSP平臺中找出相對應的靶點，將靶點數(shù)據(jù)進一步通過UniProt數(shù)據(jù)庫、TTD、drugbank數(shù)據(jù)庫確認。選擇物種為人(Human)作為研究對象，最終得到苦丁茶活性成分的作用靶點182個。

1.3網(wǎng)絡構建和分析使用可以圖形化顯示并可進行分析和編輯的軟件Cytoscape(版本3.6.1)，將候選化合物與其潛在的靶點蛋白生成一個體現(xiàn)藥物靶點相互作用的網(wǎng)絡圖，并根據(jù)得出的潛在靶點在TCMSP平臺中找出相關的疾病(種)，生成靶點疾病相互作用網(wǎng)絡圖，進而可生成化合物疾病相互作用網(wǎng)絡圖。

1.4GO及pathway富集分析為了揭示互作蛋白在基因功能上的富集情況，將CTD在線分析平臺篩選182個靶點蛋白導入Funrich軟件(版本3.1.3)，通過軟件的Gene enrichment模塊進行 GO及 pathway 富集分析。

2 結果與分析

2.1活性化合物篩選如表1所示，以OB≥28%和DL≥0.18作為篩選條件得到13個活性成分。

表1 苦丁茶的活性化合物

2.2活性成分-靶點網(wǎng)絡分析將篩選出的13個活性成分和靶點相連構建活性成分-靶點(components-targets，C-T)網(wǎng)絡圖，如圖1所示，其中包含191個節(jié)點nodes(9個活性成分和182個靶點)；V形節(jié)點代表活性成分，圓形節(jié)點節(jié)點代表靶點，而邊則表示活性成分與靶點的相互作用關系。在網(wǎng)絡中，節(jié)點的網(wǎng)絡度和介數(shù)值與節(jié)點的重要性成正比，節(jié)點的大小也反映度的大小，如表2所示，其中黃酮類MOL000098(槲皮素)度數(shù)最大(154個靶點)，為網(wǎng)絡的中心節(jié)點；其次是黃酮類MOL000422(山柰酚)有63個靶點、萜類MOL000358(β-谷甾醇)有38個靶點、黃酮類MOL006505(表兒茶素)有32個靶點。靶點較多的成分可能在苦丁茶發(fā)揮藥理功能中起重要作用，從表2可以看出苦丁茶的良好生物活性主要與黃酮類化合物或萜類有關。文獻報道也驗證了預測結果，黃酮類化合物槲皮素、山柰酚、表兒茶素均被證明具有降壓、降血脂、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[5-8]，此外，β-谷甾醇也被證明具有抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗高血脂、抗動脈硬化、抑制血小板聚集等廣泛的藥理活性[9]。

在靶點上，G1氨基丁酸A型受體α1(GBRA1)、前列腺素H2(PGH2)、重組蛋白PKAca、前列腺素H1(PGH1)、類固醇受體激活蛋白2(NCOA2)、熱休克蛋白90B(HS90B)、重組人胱天蛋白酶(CASP3)的度值較高，它們分別與7、6、5、5、5、5、5個活性化合物相互作用(圖1和表2)，表明活性成分在靶點上具有協(xié)同性，是苦丁茶發(fā)揮整體藥效作用的關鍵靶標。在靶點數(shù)目上，以黃酮類活性成分靶點最多(220個)，其次是萜類(44個)和酚類(43個)，說明這些成分之間有著較強的協(xié)同作用，故而貢獻多維藥理活性。

表2 苦丁茶中的化學成分-靶向蛋白的網(wǎng)絡度和介數(shù)值

2.3靶點-疾病及主要活性成分-疾病網(wǎng)絡分析通過CTD在線分析平臺將篩選182個靶點與疾病相連接構建靶點-疾病(targets-diseases，T-D)網(wǎng)絡圖，如圖2所示，其中包含348個節(jié)點nodes(82個蛋白靶點和266種疾病)。266種疾病中主要包括腫瘤(50種)、心腦血管疾病(49種)、炎癥(19種)和微生物感染(10種)等幾大類。

為了直觀地反映活性成分與疾病之間的關系，選擇相關度高的活性化合物和靶點與相關疾病構建C-T-D網(wǎng)絡(疾病節(jié)點只顯示degree≥6)。從圖3可以看到有超過50%的疾病與腫瘤、炎癥和心腦血管疾病相關。目前，苦丁茶已被證實可治療原發(fā)性高血壓及心腦血管疾病等的頭昏、頭痛、胸悶、乏力、失眠，降低血壓、血脂，改善血液流變學狀態(tài)的作用，具有很好的開發(fā)利用前景[10]。研究表明，苦丁茶具有較好的體外抗MCF-7人乳腺癌細胞活性，其水提物(200 μg/mL)抑制率達81%，并且研究還發(fā)現(xiàn)能減弱炎癥相關因子NF-kB、iNOS和COX-2的表達，展現(xiàn)了良好的抗炎特性[11]。此外，苦丁茶黃酮還可通過caspases活化誘導人HSC-3口腔癌細胞凋亡[12]。這些研究均與網(wǎng)絡分析的結果一致。

2.4通路富集分析和構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡將CTD在線分析平臺篩選182個靶點蛋白導入Funrich軟件進行了GO和pathway富集分析。GO可分為分子功能、生物過程和細胞組成3個部分。GO富集分析可以粗略了解差異基因富集在哪些生物學功能、途徑或者細胞定位，通過GO富集分析(P<0.05)，如圖4所示，分子功能、細胞組分及生物過程3個部分分別顯著富集到20、65和13個條目。分析結果表明，其分子功能與氧化還原酶活性和細胞因子活性相關性最大；細胞組分與細胞外隙和細胞外基質相關性最大；生物過程與能量途經(jīng)和新陳代謝相關性最大。

圖1 苦丁茶中的活性成分-靶點網(wǎng)絡圖Fig.1 The components-targets network

圖2 靶點-疾病網(wǎng)絡圖Fig.2 The targets-diseases network

對差異基因進行pathway分析，可以了解試驗條件下顯著改變的代謝通路，在機制研究中顯得尤為重要。通過pathway分析(P<0.01)，富集到283條pathway，圖5顯示最為顯著的6條pathway分析結果，包括AP-1轉錄因子網(wǎng)絡、整合素連接激酶信號、由VEGFR1 and VEGFR2介導的信號事件、VEGF and VEGFR信號網(wǎng)絡、LKB1 信號事件以及IFN-γ通路。這些信號通路與乳腺癌、黑色素瘤等癌癥以及心腦血管疾病有密切關系。

圖4 基因本體富集分析Fig.4 Enrichment analysis by gene ontology

圖5 生物通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis by biological pathway

3 結論

綜上所述，該研究應用網(wǎng)絡藥理學方法初步研究了苦丁茶的活性成分、靶點、相關疾病及其疾病系統(tǒng)和作用生物通路，共發(fā)現(xiàn)苦丁茶活性成分共13個，進一步通過網(wǎng)絡分析篩選，得到9個主要活性成分，作用靶點182個，關聯(lián)通路6條，治療疾病262種，主要用于治療癌癥、炎癥、心腦血管等疾病，由此可見苦丁茶治療疾病的廣泛性，具有多成分-多靶標-多通路的特點。靶點GBRA1、PGH2、PKAca、PGH1、NCOA2、HS90B、CASP3互作的相關活性成分較多，可能是苦丁茶活性成分發(fā)揮藥效作用的關鍵靶標。相關的通路均與癌癥和心腦血管疾病有關。這些研究結果從網(wǎng)絡藥理學角度揭示了苦丁茶的主要活性成分及其作用靶點、主要疾病類型及關鍵生物通路，為進一步研究其藥理作用機制奠定了良好基礎。