王 玉，李 濤，徐 楓

（太湖流域水文水資源監(jiān)測(cè)中心，江蘇 無錫 214024）

藻類在自然水域中的種類分布極為廣泛，它們對(duì)自身生存環(huán)境水質(zhì)的變化較為敏感。在水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)研究中藻類監(jiān)測(cè)日益受到人們的重視。藻類群落的監(jiān)測(cè)內(nèi)容主要是種類、數(shù)量、生物量等，是水體富營(yíng)養(yǎng)化程度的重要指示指標(biāo)。傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法為人工鑒定，利用光學(xué)顯微鏡直接觀測(cè)藻類以獲得所需數(shù)據(jù)，需要復(fù)雜的人工操作和專業(yè)的生物學(xué)分類知識(shí)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能及時(shí)反映水體污染狀況，且不能進(jìn)行原位、實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，難以滿足種群動(dòng)力學(xué)觀測(cè)量大、連續(xù)的要求[1]，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。在指導(dǎo)生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用中，需要方便、快捷、直觀的藻類在線監(jiān)測(cè)技術(shù)。比較分析現(xiàn)有的藻類在線監(jiān)測(cè)技術(shù)，并著重介紹自主構(gòu)建的一種適用于淺水湖泊的流式細(xì)胞儀藻類在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，以期為淺水湖泊的藻類在線監(jiān)測(cè)提供新方法。

1 藻類在線監(jiān)測(cè)技術(shù)

近 20 a 來，熒光技術(shù)在藻類監(jiān)測(cè)方面取得很大發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了建立在葉綠素?zé)晒庠砘A(chǔ)上的藻類在線監(jiān)測(cè)。目前已有的藻類在線監(jiān)測(cè)技術(shù)主要分為以下 3 類：1）主要監(jiān)測(cè)水體中的葉綠素含量，但不具備藻類分類功能，僅適用于監(jiān)測(cè)水體中葉綠索的變化趨勢(shì)[2]。2）利用不同的激發(fā)光源，根據(jù)特征光譜可將水體中的藻類區(qū)分四大類藻類（藍(lán)藻、綠藻、硅藻、隱藻），并對(duì)藻細(xì)胞數(shù)量或生物量進(jìn)行定量，在監(jiān)測(cè)葉綠素、藻類數(shù)量變化和種群更迭上取得了直觀的效果，適用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)和預(yù)警工作[3]。但不同水體需要確立不同參數(shù)，在使用過程中結(jié)果易受到不同藻類熒光遮擋、泥沙和光照等因素的影響，在使用過程中應(yīng)盡量調(diào)整參數(shù)至精準(zhǔn)，增大檢測(cè)頻次減少光照對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[4]。3）流式細(xì)胞儀藻類在線監(jiān)測(cè)，流式細(xì)胞技術(shù)是指對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)[5]?？蓪?duì)水體中的藻類進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)，依據(jù)不同類群所含特征色素及粒徑區(qū)別，可進(jìn)一步細(xì)分到種的級(jí)別，其應(yīng)用在小粒徑的鏈狀藻占優(yōu)勢(shì)的海域，可以有效地避免分粒級(jí)過濾中的誤差，從而準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)藻類群落的粒級(jí)結(jié)構(gòu)[6]。

2 流式細(xì)胞儀藻類在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)架構(gòu)

已有的水下在線浮游植物流式細(xì)胞儀（CytoSub）主要適用于深水湖泊或海洋，無法應(yīng)用于太湖這類淺水湖泊。為了實(shí)現(xiàn)太湖的藻類在線監(jiān)測(cè)，自主設(shè)計(jì)構(gòu)建了基于便攜式浮游植物流式細(xì)胞儀（CytoSense）的藻類在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

2.1 構(gòu)建思路

荷蘭的 CytoSense 流式細(xì)胞儀工作原理：樣品中的懸浮顆粒在鞘液的包被下呈單行排列，依次流經(jīng)檢測(cè)區(qū)域。在檢測(cè)區(qū)，激光束照射在通過的顆粒上，一方面由于顆粒大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)等的差異向四周發(fā)射不同角度的散射光；另一方面顆粒吸收光能激發(fā)不同波長(zhǎng)或顏色的熒光，而這些散射光和熒光都能被不同的檢測(cè)器檢測(cè)產(chǎn)生信號(hào)。發(fā)射熒光經(jīng)一系列雙色反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了細(xì)胞顆粒內(nèi)含有相關(guān)熒光物質(zhì)的濃度。通過這些表征顆粒不同性質(zhì)的光信號(hào)就可將不同類型的顆粒區(qū)分開來，如圖1 所示。

圖1 CytoSense 分析原理圖

經(jīng)過多年的發(fā)展，該流式細(xì)胞儀已具備在線監(jiān)測(cè)功能，可通過其控制軟件 CytoUSB 設(shè)置檢測(cè)時(shí)間，定時(shí)開展檢測(cè)。但由于其不具備在野外直接工作的能力，需要為其提供站房、供電、空調(diào)等條件，且其內(nèi)部只有一個(gè)較小的蠕動(dòng)泵用于進(jìn)樣，進(jìn)樣管長(zhǎng)度有限，不具備直接抽取自然水樣進(jìn)行檢測(cè)的能力，需要為其提供水樣?；谝陨?2 點(diǎn)，選擇將該設(shè)備放置于已有站房中，設(shè)計(jì)構(gòu)建取排水和清洗管路、電子控制等系統(tǒng)及取樣水池硬件，并編制控制整個(gè)系統(tǒng)有序運(yùn)行的軟件。在整個(gè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)中，主要有以下 3 個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)：

1）該系統(tǒng)在采樣過程中使用蠕動(dòng)泵代替簡(jiǎn)單的自吸泵，盡可能地減少采樣過程中對(duì)藻類的傷害，監(jiān)測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確；而傳統(tǒng)的藻類監(jiān)測(cè)技術(shù)則需利用固定劑固定藻類，對(duì)藻細(xì)胞有所損傷，且在運(yùn)輸及保存過程中的顛簸也會(huì)對(duì)藻類細(xì)胞造成影響。

2）針對(duì)太湖藻類以微囊藻為主要優(yōu)勢(shì)種的特點(diǎn)，為了獲得較為準(zhǔn)確的藻類細(xì)胞數(shù)量，加入了水樣前處理，通過超聲破碎的物理方法將藻類大團(tuán)體打散為小團(tuán)體甚至單體，同時(shí)通過磁力攪拌器對(duì)水樣進(jìn)行攪拌，避免藻類上浮影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3）針對(duì)水體中不同深度的藻類分布不同的情況，設(shè)計(jì)了 3 個(gè)取水管路，能夠采集監(jiān)測(cè)水體垂直方向不同水深處的藻類樣本，以獲取水體垂直方向上不同位置處的藻類數(shù)量、種群結(jié)構(gòu)的特征及變化規(guī)律。

2.2 系統(tǒng)架構(gòu)

該系統(tǒng)主要由 5 個(gè)部分組成，取排水、前處理、檢測(cè)、清洗和控制等部分，如圖2 所示。其中取排水部分包括取水管、排水管、溢流管、水池、蠕動(dòng)泵，前處理部分包括超聲細(xì)胞破碎儀、磁力攪拌器、攪拌轉(zhuǎn)子，檢測(cè)部分包括浮游植物流式細(xì)胞儀、廢液桶，清洗部分包括冷水管、熱水管、熱水器，控制部分包括主控電腦、電子控制箱、控制纜線、水位傳感器、電磁閥、相關(guān)控制軟件等。系統(tǒng)整體運(yùn)行環(huán)境需有站房，提供水、電、信息傳輸?shù)葪l件。

圖2 流式細(xì)胞儀藻類在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)示意圖

取水管伸入水體的一端分叉形成 3 支進(jìn)水管，分別伸入水體的不同深度，以獲得水體垂直方向上的藻類組成情況；取水管的另外一端連接有水池，中間通過蠕動(dòng)泵將水樣抽取到水池中，通過對(duì) 3 支進(jìn)水管上的電磁閥的開合控制，可分別抽取不同深度的水樣進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)，也可同時(shí)抽取不同深度的水樣進(jìn)行混合檢測(cè)。水池的上部側(cè)面分別連接進(jìn)水管、溢流管和清洗管，底部連接排水管，并放置有攪拌轉(zhuǎn)子和磁力攪拌器，超聲細(xì)胞破碎儀的變幅桿、水位傳感器和流式細(xì)胞儀的進(jìn)樣管分別由水池頂部伸入內(nèi)部。由于此系統(tǒng)為降低對(duì)自然水體環(huán)境的影響，直接抽取自然水體進(jìn)行檢測(cè)，未使用其他化學(xué)試劑。為防止管路和水池中滋生藻類而影響檢測(cè)結(jié)果，需對(duì)系統(tǒng)及時(shí)進(jìn)行清洗。每次檢測(cè)流程結(jié)束后，通過控制相應(yīng)管路上的電磁閥的開合，先用熱水對(duì)整個(gè)系統(tǒng)的管路及水池進(jìn)行清洗，再用冷水清洗，最大程度地殺死并沖走殘留的藻類。清洗系統(tǒng)所需水量較大，選擇直接排入自然環(huán)境，系統(tǒng)的各個(gè)設(shè)備、電子元件通過纜線與電子控制箱連接，進(jìn)而與主控電腦相連，在主控電腦相應(yīng)軟件的控制下，協(xié)同配合，完成藻類的在線監(jiān)測(cè)過程。

2.3 運(yùn)行與維護(hù)

到達(dá)預(yù)先設(shè)定好的檢測(cè)時(shí)間后，控制軟件根據(jù)檢測(cè)流程，通過電子控制箱與各個(gè)電子元件之間保持聯(lián)系，發(fā)送指令、接收反饋信號(hào)，以完成對(duì)整個(gè)檢測(cè)流程的控制。蠕動(dòng)泵抽取指定水層的水樣，并送入水池，當(dāng)水池中的水達(dá)到指定深度時(shí)，停止采樣，對(duì)水樣進(jìn)行超聲處理后，流式細(xì)胞儀開始檢測(cè)工作，檢測(cè)工作完成后將水池中的水排向自然水體。當(dāng)分別完成 3 層水體的檢測(cè)后，系統(tǒng)啟動(dòng)自清洗程序，完成整個(gè)檢測(cè)流程。也可根據(jù)需要同時(shí)抽取 3 層的水體進(jìn)行檢測(cè)，或只檢測(cè)某一層的水體，靈活設(shè)定。完成檢測(cè)后，解析軟件可對(duì)檢測(cè)文件自動(dòng)進(jìn)行解析，獲得相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果。在建立好通訊條件的前提下，藻類在線監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)可及時(shí)傳回實(shí)驗(yàn)室，且使用者可以通過遠(yuǎn)程控制，實(shí)時(shí)查看系統(tǒng)運(yùn)行情況，修改檢測(cè)參數(shù)等。

該系統(tǒng)采用全儀器操作的模式，效率更高，且與遠(yuǎn)程控制系統(tǒng)相結(jié)合，方便決策者根據(jù)需要對(duì)監(jiān)測(cè)區(qū)域的藻類數(shù)目及種群結(jié)構(gòu)等作出實(shí)時(shí)原位的檢測(cè)判斷，并對(duì)藻類變化趨勢(shì)作出預(yù)測(cè)，通過終端電腦既能夠做出檢測(cè)決定并可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)藻類檢測(cè)的自動(dòng)化操作，方便快捷。

系統(tǒng)日常運(yùn)行中主要需要清洗維護(hù)，需根據(jù)水體渾濁程度及使用頻率確定維護(hù)頻率，定期更換內(nèi)部管路、補(bǔ)充儀器內(nèi)部使用的生物抑制劑、清洗或更換濾器、清洗水池等，維護(hù)過程簡(jiǎn)單，但耗時(shí)。

3 應(yīng)用實(shí)例

藍(lán)藻水華是目前全世界共同面臨的重大環(huán)境問題之一，就太湖而言，藍(lán)藻水華的發(fā)生已經(jīng)成為常態(tài)，主要發(fā)生在夏秋季節(jié)。如果水華在水源地取水口附近大量集聚就有可能引起水源地的水質(zhì)惡化，危及供水安全[7]。太湖貢湖是流域的重要水源地，實(shí)時(shí)監(jiān)控貢湖水源地的藻類數(shù)量與變化情況，及時(shí)預(yù)警藍(lán)藻水華，是太湖重要水源地管理與保護(hù)的迫切需求。

選取太湖中不同藻密度的水樣進(jìn)行檢測(cè)，該系統(tǒng)工作正常，顯示該流式細(xì)胞儀藻類在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可適應(yīng)高濃度藻類的水體。目前，該系統(tǒng)已成功應(yīng)用于太湖貢湖水源地。太湖平均水深 2 m，此系統(tǒng)分別在水下 0.5，1.0 和 1.5 m 處設(shè)置取水管，監(jiān)測(cè)頻率為每天 4～6 次，每次均對(duì)這 3 個(gè)深度的水體進(jìn)行取樣檢測(cè)。由于太湖水體較渾濁，且藻類在線監(jiān)測(cè)頻次較高，易在流式細(xì)胞儀內(nèi)部管路形成結(jié)晶，需每個(gè)月進(jìn)行 1 次系統(tǒng)清洗維護(hù)。

通過實(shí)驗(yàn)室人工鏡檢對(duì)比，借助分類軟件，可建立適用于所監(jiān)測(cè)水體的 CytoSense 浮游植物流式細(xì)胞儀的藻類數(shù)據(jù)庫，實(shí)時(shí)提供所需的藻類信息。在水體中起到?jīng)Q定作用的是藻類優(yōu)勢(shì)種，只要能夠?qū)ζ溥M(jìn)行分類和定量，就能夠?qū)崟r(shí)掌握水體中藻類的總體變化趨勢(shì)和狀態(tài)。微囊藻在太湖浮游藻類中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，是太湖藍(lán)藻水華的主要構(gòu)成種。該系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)對(duì)太湖貢湖水源地的微囊藻自動(dòng)在線監(jiān)測(cè)，可實(shí)時(shí)提供藻類和微囊藻顆粒及細(xì)胞等密度。

選取貢湖水源地 2017 年 6 月 15 日—12 月 15 日每日上午 8 時(shí)水下 0.5 m 的流式細(xì)胞儀在線監(jiān)測(cè)結(jié)果，分析微囊藻細(xì)胞密度變化情況，如圖3 所示。貢湖水源地的微囊藻細(xì)胞密度在 6 月 20 日—7 月 20 日明顯高于其他時(shí)期，微囊藻細(xì)胞密度在 6 月 30 日和7 月 7 日達(dá)到峰值之后逐漸降低至 5×104個(gè)/mL，8 月 15 日—9 月 10 日微囊藻細(xì)胞密度有所上升，9 月15 日之后微囊藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，10 月中旬至 12 月中旬微囊藻細(xì)胞密度基本維持在 4×104個(gè)/mL。

4 結(jié)語

圖3 微囊藻細(xì)胞密度變化

浮游植物流式細(xì)胞儀技術(shù)的不斷發(fā)展，使得該技術(shù)成為最有可能實(shí)現(xiàn)有害藻類早期預(yù)警的技術(shù)方法。研究的流式細(xì)胞儀藻類在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)針對(duì)太湖藍(lán)藻水華，實(shí)現(xiàn)了對(duì)優(yōu)勢(shì)種微囊藻的實(shí)時(shí)、高頻、分層監(jiān)測(cè)，為貢湖水源地的藍(lán)藻水華預(yù)警提供了有力的支撐，且系統(tǒng)維護(hù)相對(duì)簡(jiǎn)單，具有較高的實(shí)用性。但是，流式細(xì)胞術(shù)主要是根據(jù)細(xì)胞大小及色素差異對(duì)一些特定類群藻類進(jìn)行識(shí)別，對(duì)于室內(nèi)培養(yǎng)的純種藻分類效果較好，而野外樣品要復(fù)雜的多，且藻的差異較大。此系統(tǒng)應(yīng)用于其他淺水湖泊，需要使用者根據(jù)實(shí)際情況建立適用于該水體的藻類信息數(shù)據(jù)庫，方可實(shí)現(xiàn)部分藻類的自動(dòng)分類。

太湖的貢湖湖區(qū)是典型的淺水湖灣，該系統(tǒng)在貢湖的成功應(yīng)用，說明其適用于淺水湖泊的藻類在線監(jiān)測(cè)，有一定的推廣意義。流式細(xì)胞儀功能強(qiáng)大，優(yōu)勢(shì)明顯，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)逐步探索形成標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測(cè)方法，以便推廣應(yīng)用。