馮 晉 任儀鵬 董麗平

口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral cavity squamous cell carcinoma,OSCC)，是頭頸部惡性腫瘤的一種，在所有新發(fā)的惡性腫瘤病例中約占3%[1]。其極具侵襲性、轉(zhuǎn)移性以及復(fù)發(fā)性的特點使該腫瘤的治療手段效果有限，嚴(yán)重威脅人類生命健康。因此闡明OSCC分子機制，探尋影響OSCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶分子是研究OSCC亟待解決的關(guān)鍵問題。大量文獻(xiàn)報道，人類的叉頭框(FOX)基因家族是一種至少由43個成員組成的轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)節(jié)各種各樣的生物進化過程，并參與腫瘤的發(fā)展[2]。叉頭框C1(FOXC1)轉(zhuǎn)錄因子基因，是叉頭框家族的一員，它位于染色體6p25[3]，調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞分化狀態(tài)、胚胎發(fā)育，此外也包括腫瘤發(fā)生和發(fā)展。然而FOXC1是否參與口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后報道較少。為進一步了解FOXC1在OSCC惡性生物學(xué)行為中的作用，本研究構(gòu)建過表達(dá)FOXC1的OSCC細(xì)胞系SCC-9-FOXC1，通過上調(diào)FOXC1的表達(dá)，評估SCC-9細(xì)胞增殖活性、凋亡水平和細(xì)胞運動遷移能力，為闡明FOXC1在OSCC中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1材料 口腔鱗癌細(xì)胞系SCC-9細(xì)胞購自中國科學(xué)院。胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)購自Solarbio公司；Lipofectamine R○3000購自invitrogen公司；Annexin V-FITC/PIApoptosis Kit、Cell Cycle Staining Kit購自聯(lián)科生物；氨芐青霉素、LB瓊脂購自海博生物；質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生物；CCK8檢測試劑盒、FOXC1抗體購自凱基生物。

1.2方法

1.2.1 FOXC1過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建NCBI查找FOXC1的基因的CDS序列，添加酶切位點BamHI/XbaI,與載體plvxpuro連接，構(gòu)建慢病毒重組載體FOXC1-plvxpuro，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，對質(zhì)粒給予電泳驗證。

1.2.2 FOXC1過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染SCC-9細(xì)胞 實驗分為三組：(1)空白對照組(2)慢病毒空載體組(3)FOXC1過表達(dá)組。按照Lipofectamine R○3000試劑使用說明，低溫環(huán)境下配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，并室溫避光孵育1h后，將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入至細(xì)胞中。在培養(yǎng)板上標(biāo)記各組別，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞。

1.2.3 q-PCR檢測3組細(xì)胞FOXC1的表達(dá)情況 根據(jù)FOXC1基因序列，設(shè)計其特異檢測引物，F(xiàn)OXC1和GAPDH特異檢測引物見表1，以經(jīng)FOXC1過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染SCC-9細(xì)胞的總RNA為模板，q-PCR檢測各基因的表達(dá)情況，空白對照和空載感染的SCC-9細(xì)胞的同樣檢測作為對照，GADPH基因的相同檢測作為內(nèi)參。

1.2.4 Western Blot檢測3組細(xì)胞FOXC1的表達(dá)情況 取各組細(xì)胞進行加入組織裂解液，裂解30min后，4℃，10000rpm/min離心10min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，再進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50min。4℃孵育一抗過夜；二抗溶液中室溫孵育1～2h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。利用“Quantity one”軟件進行各抗體條帶灰度值的分析。

表1 本研究所用的引物序列

1.2.5 CCK8檢測細(xì)胞增殖 棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的含10μL的毒性檢測液CCK8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，用酶標(biāo)儀測波長為450nm的OD值。實驗重復(fù)3次，取實驗結(jié)果的平均值作為最終實驗結(jié)果。

1.2.6細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 直尺和marker筆在操作前紫外照射30min(超凈臺內(nèi))。先用marker筆在24孔板背后，用直尺比著孔的正中央，均勻地劃橫線，橫穿過孔。在孔中加入約5×105個細(xì)胞。次日用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕。PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37度5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

1.2.7流式檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染48h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化1min，加入含10%FBS的DMEM，將細(xì)胞吹打下來并吸取到1.50mL離心管中，離心，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次(2000rpm離心5min)，收集1-5×105細(xì)胞，再加入1mL70%的乙醇溶液,放入4℃條件下兩小時進行細(xì)胞固定。

1.2.8流式檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種于6孔板。48h后，消化收集細(xì)胞，避光染色30min上機檢測。按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，在1h內(nèi)進行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.9統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均用Graph Pad Prism 7統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析比較三組及以上組間差異，兩組比較時采用t檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05作為顯著性差異，以*表示。

2.結(jié)果

2.1過表達(dá)FOXC1細(xì)胞系SCC-9-FOXC1的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染效率鑒定 首先提取重組質(zhì)粒FOXC1-plvxpuro，經(jīng)BamHI/XbaI酶切后，理論上應(yīng)該得到8071bp和1674bp的條帶，酶切結(jié)果如圖1所示，電泳檢測結(jié)果與理論值相符，證明FOXC1過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建正確。

圖1 酶切電泳示意圖

隨后Real-time PCR對三種口腔鱗癌細(xì)胞系SCC-9，轉(zhuǎn)入空載體的SCC-9細(xì)胞SCC-9 vector以及過表達(dá)FOXC1基因的SCC-9細(xì)胞SCC-9 FOXC1中目的基因FOXC1的mRNA水平進行檢測，結(jié)果如圖2a所示。試驗結(jié)果表明，與對照組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染FOXC1的細(xì)胞中，F(xiàn)OXC1 mRNA顯著高表達(dá)(P＜0.05)。進一步應(yīng)用Western blot檢測FOXC1在上述三種細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。如圖2b所示，F(xiàn)OXC1蛋白在三株細(xì)胞中均有表達(dá)，但是在與對照組相比，實驗組細(xì)胞中FOXC1的表達(dá)更高。以上試驗提示，上述基因轉(zhuǎn)染體系成功、完整，所構(gòu)建的FOXC1過表達(dá)的細(xì)胞可用于后續(xù)生物學(xué)功能的試驗。

2.2過表達(dá)FOXC1基因顯著抑制口腔鱗狀細(xì)胞增殖 為了檢測上調(diào)FOXC1是否對SCC-9細(xì)胞的增殖活力產(chǎn)生影響，我們應(yīng)用CCK-8試劑對三株細(xì)胞的增殖活力進行了檢測。如圖3所示，與對照組SCC-9和SCC-9vector相比，過表達(dá)FOXC1細(xì)胞的活力受到顯著抑制(P＜0.05)，在相同的培養(yǎng)時間和處理條件下，實驗組細(xì)胞的增殖活力約為對照組的1/4。為了進一步明確其增殖活力被抑制可能的機制，我們又對三株細(xì)胞進行了細(xì)胞周期檢測，試驗結(jié)果表明(圖4)，實驗組細(xì)胞周期與對照組不同，G2期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞顯著增多(P＜0.05)，提示過表達(dá)FOXC1后，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了S期阻滯。上述試驗結(jié)果表明，過表達(dá)FOXC1可以在一定程度上通過對腫瘤細(xì)胞生長過程中S期的阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活力。

圖2 FOXC1過表達(dá)于SCC-9細(xì)胞

圖3 過表達(dá)FOXC1抑制SCC-9細(xì)胞增殖

2.3過表達(dá)FOXC1基因顯著促進口腔鱗癌細(xì)胞凋亡 通過流式細(xì)胞儀對三株細(xì)胞系的凋亡能力進行比較(圖5)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實驗組細(xì)胞凋亡能力明顯升高，凋亡細(xì)胞比例約為對照組的3倍(P＜0.05)，提示FOXC1的上調(diào)可以促進SCC-9細(xì)胞的凋亡。

圖4 過表達(dá)FOXC1阻滯細(xì)胞S期

圖5 過表達(dá)FOXC1促進腫瘤細(xì)胞凋亡

2.4過表達(dá)FOXC1基因顯著抑制口腔鱗癌細(xì)胞遷移和運動 口腔鱗癌細(xì)胞因具有較強的遷移運動能力而更易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響預(yù)后。通過細(xì)胞劃痕試驗，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FOXC1后，細(xì)胞的遷移能力有所下降，約為空白對照組的1/2。值得一提的是，在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入空載體的細(xì)胞與空白對照相比，其運動能力也有所下降(P＜0.05)，這可能是由于在細(xì)胞轉(zhuǎn)染的過程中，空載體對細(xì)胞的運動能力能夠造成一定程度的抑制。盡管如此，我們可以看到，與空載體組相比，試驗組細(xì)胞的運動能力仍顯著降低(P＜0.05)，高度提示FOXC1的上調(diào)是造成SCC-9細(xì)胞運動能力下降的關(guān)鍵因素。

圖6 過表達(dá)FOXC1抑制腫瘤細(xì)胞運動

3.討論

口腔惡性腫瘤是頭頸部惡性腫瘤的一種。由于該疾病起病隱匿，易于侵犯臨近組織，給該疾病的治療帶來一定的難度，口腔惡性腫瘤的個體化和分子靶向治療也發(fā)展較慢，上述種種因素最終導(dǎo)致該疾病預(yù)后較差，五年生存率較低[4,5]。

轉(zhuǎn)錄因子FOXC1屬于FOXC家族,該家族目前發(fā)現(xiàn)2個成員,分別為FOXC1和FOXC2。早期對FOXC1的研究發(fā)現(xiàn),其主要與Axenfeld-Rieger綜合癥和胚胎發(fā)育有關(guān)[6-9]，近年來的研究表明，F(xiàn)OXC1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。然而關(guān)于FOXC1在腫瘤中究竟扮演癌基因還是抑癌基因的角色，現(xiàn)有報道仍未達(dá)成普遍共識。一方面，Hayashi等[10]發(fā)現(xiàn)FOXC1與Notch信號和血管內(nèi)皮生長因子相互作用多步驟地調(diào)節(jié)血管基因的表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤血管生成；Wang等[11]研究顯示在人基底樣乳腺癌中FOXC1可以通過激活NF-κB信號通路促進體外癌細(xì)胞系的增殖、侵襲及遷移。另一方面，Zhou等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以通過上調(diào)FOXC1的表達(dá)從而負(fù)性調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的增殖，間接提示FOXC1可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展；我國學(xué)者任琛琛等[13]研究也表明，上調(diào)FOXC1的表達(dá)可以顯著抑制胰腺癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞的增殖和侵襲能力。正因如此，科學(xué)家給出的解釋是：FOXC1表達(dá)水平的精準(zhǔn)調(diào)控是維持機體穩(wěn)態(tài)的重要因素，一旦FOXC1表達(dá)失調(diào)，無論過高或過低可能都會引起機體穩(wěn)態(tài)失衡，進而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。關(guān)于FOXC1表達(dá)精準(zhǔn)調(diào)控的觀點也有證據(jù)可循，有研究發(fā)現(xiàn)FOXC1拷貝數(shù)的增加或減少都可以導(dǎo)致視前段發(fā)育缺陷，這說明FOXC1基因表達(dá)水平的精確調(diào)控對正常發(fā)育亦至關(guān)重要[6]。

口腔鱗狀細(xì)胞癌的分子生物學(xué)機制[14,15]是一個多基因參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程，目前人們對口腔鱗癌潛在分子機制了解較少。因此，在本研究中，我們揭示了FOXC1參與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程，并證實過表達(dá)FOXC1會在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，并能夠促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過進一步探討FOXC1在口腔鱗癌中的確切分子機制，或可為今后口腔鱗癌的個體化治療提供新的靶點和有效治療策略。