胡慶娟，吳光杰，牛慶川，白書(shū)瑜，賀文杰，宋 皓，李玉萍*

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013）

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為藥食兩用的一年生草本植物，具有保護(hù)神經(jīng)[1-2]、抗菌[3]、抗糖尿病[4-5]、抗氧化[6]、抗炎[7]、抗癌[8-10]等多種功效。研究表明馬齒莧中含有生物堿、黃酮、多糖、多巴胺等多種生物活性成分[11-15]。其中，馬齒莧多糖（polysaccharide from Portulaca oleracea L.，POP）是其主要活性成分之一，具有提高免疫力、抗病毒、降糖調(diào)脂、抗癌及抗衰老等生物活性[6,10,16-23]。

在提取POP的過(guò)程中，一般采用傳統(tǒng)的Sevag法、三氯乙酸法和鹽酸法脫除馬齒莧多糖蛋白[24-25]，尚鮮見(jiàn)木瓜蛋白酶法脫除馬齒莧多糖蛋白的報(bào)道。以上幾種脫除馬齒莧多糖蛋白的方法需使用大量有機(jī)溶劑、步驟復(fù)雜、耗費(fèi)大量時(shí)間，且存在大量多糖損失等問(wèn)題[24-25]。酶促反應(yīng)溫和，可以水解較少的與多糖結(jié)合牢固的蛋白或被多糖包裹的蛋白，將糖釋放出來(lái)，提升多糖得率。已有實(shí)驗(yàn)研究表明，相比于胰蛋白酶和中性蛋白酶，木瓜蛋白酶的脫蛋白效果更好[26]。響應(yīng)面法能以最簡(jiǎn)單、高效的方式充分考慮各試驗(yàn)因素的交互作用，被廣泛應(yīng)用于分離提取的工藝優(yōu)化和過(guò)程控制。

為此，本實(shí)驗(yàn)以POP損失率與POP溶液中蛋白去除率作為考察指標(biāo)，探討木瓜蛋白酶法脫除馬齒莧多糖蛋白的效果，同時(shí)采用響應(yīng)面法優(yōu)化脫蛋白工藝，確定其最佳脫蛋白工藝；并對(duì)所獲取的POP進(jìn)行分離純化以及高效液相色譜鑒定，確定POP所含的單糖種類(lèi)，旨在為研究POP的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬齒莧購(gòu)于江西省南昌市某蔬菜批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室鑒定，洗凈烘干粉碎后備用。

牛血清白蛋白 杭州四季青生物工程材料有限公司；木瓜蛋白酶（≥3 U/mg）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 美國(guó)Aladdin公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 碧云天生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、DEAE-52纖維素、Sephadex G-200 北京Solarbio公司；葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸 美國(guó)Sigma公司；葡聚糖中國(guó)計(jì)量科學(xué)院；所用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

D-63505鼓風(fēng)干燥箱 美國(guó)Thermo公司；FW-177粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；HH5電熱恒溫水浴鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)Unico公司；JJ500精密電子天平 美國(guó)雙杰兄弟公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；PHS-29A數(shù)顯酸度計(jì) 上海虹益儀器有限公司；1100型高效液相色譜儀 美國(guó)Aglient公司；BSZ-100B型自動(dòng)部分收集器、DHL-A型電腦恒流泵 上海瀘西分析儀器廠；真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Labxonco公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；5804R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；F-2700熒光分光光度計(jì) 日本Corporation公司。

1.3 方法

1.3.1 POP的制備

將馬齒莧粉末進(jìn)行分組包裝（20 g/個(gè)）放置在索氏提取器內(nèi)，加入150 mL的石油醚，90 ℃回流2 h，溶劑揮干后，重新置于索氏提取器中，加80%乙醇溶液150 mL于圓底燒瓶中，90 ℃回流2 h，將處理好的馬齒莧粉末在通風(fēng)處揮干備用。按照水料比15∶1（mL/g）、提取溫度90 ℃，提取時(shí)間分別按照90、60、30 min提取3 次，4 層濾布過(guò)濾，收集濾液，合并3 次濾液，4 000 r/min離心10 min[27]，收集所有上清液。將所得上清液減壓濃縮，然后用80%乙醇溶液醇沉[27]，4 ℃過(guò)夜。離心，分別用無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚洗滌沉淀，之后用適量水溶解。以大孔樹(shù)脂用量60 g/L加入AB-8樹(shù)脂、脫色時(shí)間3.5 h、脫色溫度50 ℃進(jìn)行脫色[28]，過(guò)濾離心，80%乙醇溶液醇沉，4 ℃過(guò)夜，離心之后用適量水溶解沉淀，冷凍干燥，得到粗提POP。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[24]檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。配制考馬斯亮藍(lán)G-250染液。配制1 mg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，分別移取0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)液于具塞試管內(nèi)，用蒸餾水補(bǔ)到1 mL，逐管加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，立刻渦旋混合，放置2 min后，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為X軸，吸光度為Y軸，作回歸曲線，得回歸方程：Y=0.825 7X+0.016 3，R2=0.998 4。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：采用蒽酮-硫酸法[29]檢測(cè)多糖含量。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別精確移取1.0 mL系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于具塞試管內(nèi)，用1.0 mL蒸餾水當(dāng)作空白對(duì)照，逐管加入4.0 mL蒽酮-硫酸試液（0.3 mg/mL，現(xiàn)配）。迅速搖勻，將全部試管一起放在沸水浴中加熱7 min，最后用流動(dòng)的水冷卻到室溫。放置10 min之后，在580 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。以葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為X軸，吸光度為Y軸，作回歸曲線，得回歸方程Y=9.638 6X+0.017 6，R2=0.997。

1.3.3 POP損失率及蛋白去除率的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，按照公式（1）計(jì)算蛋白去除率：

式中：A0表示脫蛋白前樣品中蛋白含量；A1表示脫蛋白后樣品中蛋白含量。

采用蒽酮-硫酸法，按照公式（2）計(jì)算多糖損失率：

式中：B0表示脫蛋白前樣品中多糖含量；B1表示脫蛋白后樣品中多糖含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在酶解時(shí)間3 h、酶解溫度60 ℃、pH 6.0的條件下，分別以0.05∶1、0.1∶1、0.15∶1、0.2∶1、0.25∶1、0.3∶1的酶液-樣液體積比（酶液1 000 U/mL，樣液10 mg/mL），進(jìn)行酶法脫蛋白，之后在沸水浴中加熱滅活10 min，4 000 r/min離心10 min，除去蛋白取上清液，用80%乙醇溶液醇沉4 ℃過(guò)夜，除去乙醇將多糖復(fù)溶，測(cè)得其多糖及蛋白質(zhì)量濃度，根據(jù)1.3.3節(jié)的公式得出POP損失率及POP中蛋白去除率，考察酶液-樣液體積比對(duì)木瓜蛋白酶法脫蛋白的影響。

在酶液-樣液體積比0.2∶1、酶解溫度60 ℃、pH 6.0的條件下，分別酶解1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，考察酶解時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶法脫蛋白的影響。

以酶液-樣液體積比0.2∶1、pH 6，分別在40、50、60、70、80 ℃溫度條件下酶解3 h，考察酶解溫度對(duì)木瓜蛋白酶法脫蛋白的影響。

以酶液-樣液體積比0.2∶1、酶解溫度60 ℃，分別在pH 3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.5條件下酶解3 h，考察pH值對(duì)木瓜蛋白酶法脫蛋白的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取酶液-樣液體積比（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）、pH值（D）為自變量，以POP中蛋白去除率與多糖損失率的比值為響應(yīng)值（Y），應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)原理，采用4因素3水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化POP木瓜蛋白酶法脫蛋白工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the optimization parameters used in Box-Behnken experimental design

1.3.6 POP的分離純化

稱(chēng)取350 mg粗提POP溶于蒸餾水中，終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，上樣至纖維素DEAE-52陰離子交換層析柱（2.8 cm×60 cm）中，隨后用0.1～0.4 mol/L NaCl溶液（流速1 mL/min，溫度20～25 ℃）梯度洗脫，用數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，每10 min收集一管（10 mL/管），并用蒽酮-硫酸法逐管檢測(cè)多糖含量，收集主峰部分，得到2 個(gè)主要組分，依次命名為POP-A和POP-B。然后將收集液上Sephadex G-200凝膠柱（1.5 cm×60 cm）進(jìn)一步純化，0.05 mol/L NaCl溶液（流速0.5 mL/min）洗脫，每隔4 min收集一次（2 mL/管），蒽酮-硫酸法跟蹤測(cè)定多糖含量，收集主峰的部分，蒸餾水透析24 h，然后減壓濃縮，冷凍干燥得純化POP樣品。

色譜條件：Phenomenex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；示差折光檢測(cè)器；以乙腈-磷酸鹽（pH 6.8)緩沖液（18∶82，V/V）為流動(dòng)相；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化：取100 μL 10 種標(biāo)準(zhǔn)單糖（果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，質(zhì)量濃度均為0.5 g/L，等比例混合）的混合溶液加入到1 mL的具塞試管中，然后再加100 μL 0.6 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻。取50 μL的混合液于5 mL的具塞試管中，加入50 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，振蕩混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min，取出放置10 min冷卻至室溫，加0.3 mol/L的鹽酸溶液50 μL中和，加水至1 mL，加入等體積氯仿，晃搖，靜置，除去氯仿相，如此反復(fù)萃取3 次，0.45 μm水相微孔膜過(guò)濾后供高效液相色譜進(jìn)樣分析，參考文獻(xiàn)[30]。

取100 μL含量較多的POP-A組分（5 g/L）溶液至5 mL的具塞試管內(nèi)，加入100 μL的4 mol/L TFA，充N(xiāo)2封管，110 ℃烘箱中水解2 h，冷卻后開(kāi)蓋，加入200 μL甲醇，之后用N2吹干，如此反復(fù)3 次，徹底除去TFA。然后加入50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，將殘?jiān)浞秩芙?，再加?0 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液，振蕩混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min，冷卻之后用單糖衍生化法中和、萃取，并用微孔膜過(guò)濾后供高效液相色譜進(jìn)樣分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Design-Expert 8.0、Excel等分析軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶液-樣液體積比對(duì)多糖損失率和蛋白去除率的影響

圖1 酶液-樣液體積比對(duì)脫蛋白效果的影響Fig. 1 Effect of enzyme to sample ratio on deproteinization efficiency

由圖1可以看出，當(dāng)溶液pH 6.0、60 ℃水浴中酶解3 h后，隨著木瓜蛋白酶加入量的增大，蛋白去除率逐漸增大，在體積比為0.2∶1～0.3∶1范圍內(nèi)增長(zhǎng)緩慢，分析其原因可能是隨著酶液-樣液體積比的增加，酶與底物反應(yīng)更完全，蛋白去除率效果明顯，但當(dāng)溶液中的酶含量達(dá)到一定濃度時(shí)，蛋白去除率已趨于最大值。同時(shí)隨著木瓜蛋白酶加入量的增大，多糖損失率先增加后降低之后，在體積比為0.25∶1～0.3∶1時(shí)，有稍微的平緩上升，但不明顯。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，確定酶液-樣液的較佳體積比為0.2∶1。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)多糖損失率和蛋白去除率的影響

圖2 酶解時(shí)間對(duì)脫蛋白效果的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time on deproteinization efficiency

由圖2可看出，蛋白去除率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但當(dāng)酶解時(shí)間為3～3.5 h時(shí)，蛋白去除率變化不明顯。多糖損失率則隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。因此，綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，確定較佳酶解時(shí)間為3 h。

2.1.3 酶解溫度對(duì)多糖損失率和蛋白去除率的影響

圖3 酶解溫度對(duì)脫蛋白效果的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on deproteinization efficiency

由圖3可以看出，隨著酶解溫度的升高，蛋白去除率先逐漸增加，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大，隨后隨著溫度的上升出現(xiàn)下降趨勢(shì)。多糖損失率隨著酶解溫度的上升先增加后減少，但在60 ℃后又逐漸上升，可能是因?yàn)殡S著溫度的上升，酶的活性降低，與底物反應(yīng)的能力減弱。同時(shí)，多糖損失率在40～50 ℃迅速增加，50～60 ℃出現(xiàn)下降趨勢(shì)，之后又出現(xiàn)上升趨勢(shì)，可能原因是在溫度偏低的條件下木瓜蛋白酶對(duì)多糖的降解作用會(huì)先于對(duì)蛋白的降解。當(dāng)溫度達(dá)到最佳時(shí)，木瓜蛋白酶對(duì)蛋白的降解作用加強(qiáng)，對(duì)多糖的作用減弱，隨著溫度的升高，溫度又對(duì)多糖產(chǎn)生一定的降解作用。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，確定較佳酶解溫度為60 ℃。

2.1.4 pH值對(duì)多糖損失率和蛋白去除率的影響

圖4 pH值對(duì)脫蛋白效果的影響Fig. 4 Effect of pH value on deproteinization efficiency

由圖4可知，蛋白去除率在pH 3.5～6.5之間逐漸增加，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；多糖損失率隨pH值的升高呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)。這是由于木瓜蛋白酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其在水解體系中的解離狀態(tài)和行為要受溶液pH值的影響，同時(shí)，在微酸或者微堿的環(huán)境中會(huì)加劇多糖的降解，這也可能是多糖損失率呈現(xiàn)較大波動(dòng)的原因。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，確定較佳pH值為6.0。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)酶液-樣液體積比、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值進(jìn)行分析，以POP中蛋白去除率與多糖損失率的比值（蛋白去除率/多糖損失率）為響應(yīng)值，得到試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件分析表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)，擬合得到POP的蛋白去除率/多糖損失率（Y）和酶液-樣液體積比（A）、酶解時(shí)間（B）、酶解溫度（C）、pH值（D）的方程為Y=7.48+0.072A+0.21B+0.7C-0.081D-0.47AB-0.22AC-0.23AD-0.17BC+0.19BD-0.062CD-0.5A2-1.29B2-1.41C2-2.33D2。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

由表3可知，回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，且R2為0.983 9，表明自變量與響應(yīng)值之間的模型關(guān)系顯著，即可用此模型分析和預(yù)測(cè)酶法除去POP中蛋白的結(jié)果。F值可以反映出各因素對(duì)試驗(yàn)響應(yīng)值的影響大小，由表3可知，影響的主次順序?yàn)槊附鉁囟龋久附鈺r(shí)間＞pH值＞酶液-樣液體積比，其中，酶解溫度對(duì)方程的影響極顯著。對(duì)模型各項(xiàng)進(jìn)行方差分析可知，模型中C、B、AB、A2、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值的變化起到不同程度的顯著作用，且與Y的變化不是單一的線性變化。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface plots and corresponding contour plots showing the interaction effects of various parameters

由圖5a可以看出，當(dāng)酶解溫度、pH值取固定值時(shí)，酶液-樣液體積比與酶解時(shí)間對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的交互作用明顯。當(dāng)酶液-樣液體積比取不同值時(shí)，酶解時(shí)間對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的影響表現(xiàn)出不同程度的變化；同理，當(dāng)酶解時(shí)間取不同值時(shí)，酶液-樣液體積比對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的影響也表現(xiàn)出不同程度的變化。從單個(gè)因素對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解時(shí)間對(duì)蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于酶液-樣液體積比。由圖5b可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間、pH值取固定值時(shí)，酶液-樣液體積比與酶解溫度對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。但從單個(gè)因素對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解溫度對(duì)蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于酶液-樣液體積比。由圖5c可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間、酶解溫度取固定值時(shí)，酶液-樣液體積比與pH值對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。從單個(gè)因素對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的影響看，pH值對(duì)蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于酶液-樣液體積比。由圖5d可以看出，當(dāng)酶液-樣液體積比、pH值取固定值時(shí)，酶解時(shí)間與酶解溫度對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。從單個(gè)因素對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解溫度對(duì)蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于酶解時(shí)間。由圖5e可以看出，當(dāng)酶液-樣液體積比、酶解溫度取固定值時(shí)，酶解時(shí)間與pH值對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。從單個(gè)因素對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解時(shí)間對(duì)蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于pH值。由圖5f可以看出，當(dāng)酶液-樣液體積比、酶解時(shí)間取固定值時(shí)，酶解溫度與pH值對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。從單個(gè)因素對(duì)蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解溫度對(duì)蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于pH值。

經(jīng)軟件分析計(jì)算得各因素水平最佳取值為酶液-樣液體積比0.2∶1、酶解時(shí)間3.03 h、酶解溫度62.45 ℃、pH 5.98。在此條件下的蛋白去除率為78.22%，多糖損失率為10.39%，蛋白去除率/多糖損失率比值為7.528。

2.3 POP分離純化與鑒定結(jié)果

圖6 POP分離純化曲線Fig. 6 Isolation and purification of POPs

纖維素DEAE-52交換層析對(duì)粗提POP進(jìn)行分級(jí)的洗脫曲線如圖6a所示。0.2 mol/L NaCl溶液洗脫下來(lái)的多糖洗脫量最多，0.3 mol/L NaOH溶液洗脫下來(lái)的多糖次之，0.1 mol/L及0.4 mol/L NaCl溶液洗脫下來(lái)的多糖洗脫量較少。因此，得到了2個(gè)主要組分，依次命名為POP-A和POP-B，再用凝膠Sephadex G-200進(jìn)行進(jìn)一步純化，收集分子質(zhì)量較集中的組分，作為進(jìn)一步研究的對(duì)象，見(jiàn)圖6b和6c。

2.4 POP高效液相色譜分析

圖7 標(biāo)準(zhǔn)單糖的高效液相色譜圖Fig. 7 HPLC profiles of monosaccharide standards

圖8 POP的單糖高效液相色譜圖Fig. 8 HPLC profiles of monosaccharides derived from POP

從圖7和圖8可知，POP-A單糖衍生化后得到了很好的分離。POP-A的單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其組成比例為5.3∶5.9∶1.3∶27.6∶1∶18.8∶14.6。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶法對(duì)POP溶液進(jìn)行脫蛋白處理，以蛋白去除率和多糖損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明木瓜蛋白酶法脫馬齒莧多糖蛋白的優(yōu)化條件為酶液-樣液體積比0.2∶1、酶解溫度62.45 ℃、酶解時(shí)間3.03 h、pH 5.98，但考慮到實(shí)際條件，對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行修正，最終確定優(yōu)化條件為酶液-樣液的體積比0.2∶1、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間3 h、pH 6，在此條件下蛋白去除率為78.22%，多糖損失率為10.39%，蛋白去除率/多糖損失率比值為7.528。

粗提POP經(jīng)過(guò)纖維素DEAE-52交換柱層析初步分級(jí)后得到主要組分，然后經(jīng)Sephadex G-200柱層析進(jìn)一步純化后得到純化多糖，冷凍干燥后為灰黃色棉花狀固體粉末。利用高效液相色譜進(jìn)一步分析表明，POP的單糖組成是甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其組成比例為5.3∶5.9∶1.3∶27.6∶1∶18.8∶14.6，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用POP提供參考依據(jù)。