卞慧琴，谷雨，2，陳瑾楠，王倩，呂耀娟，鄭其平，谷俊俠

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年全球約有84萬(wàn)人死于胃癌，其中發(fā)展中國(guó)家占77%，且主要集中于中國(guó)［1-2］。胃癌確診時(shí)很多已屬中晚期，主要采用手術(shù)聯(lián)合化療進(jìn)行治療。由于化療耐藥的產(chǎn)生，患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后不良［3］。前折疊素家族（PDFs）的非傳統(tǒng)成員非經(jīng)典前折疊素RPB5相互作用因子（unconventional prefoldin RPB5 interactor，URI）是一個(gè)多功能蛋白，影響細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，如真核基因轉(zhuǎn)錄及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）營(yíng)養(yǎng)敏感通路的調(diào)控、維持基因組DNA穩(wěn)定性等［4-7］。近年發(fā)現(xiàn) URI具有癌基因的特性［8-11］。我們前期的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)URI能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與遷移，增強(qiáng)對(duì)多柔比星的耐藥性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活［12］。這提示URI在胃癌細(xì)胞中起癌蛋白的作用。一個(gè)原癌基因是否在某種腫瘤中發(fā)揮作用，需要有該基因在腫瘤組織中擴(kuò)增或突變的依據(jù)。URI在胃癌組織中是否擴(kuò)增及過(guò)度表達(dá)目前并不清楚。本研究應(yīng)用胃癌組織芯片檢測(cè)了胃癌組織URI的表達(dá)并分析其與臨床特征的相關(guān)性，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)分析URI對(duì)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡的影響，以探討URI在胃癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片及細(xì)胞株 胃癌生存期組織芯片（HStm-Ade180Sur-09）購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司。芯片包含90例手術(shù)切除病理確診為胃癌患者的組織標(biāo)本，包括胃腺癌84例，其中黏液腺癌3例，腺癌中含部分印戒細(xì)胞癌5例，腺癌中含部分黏液腺癌2例；印戒細(xì)胞癌5例，其中伴部分黏液腺癌1例；高級(jí)別上皮內(nèi)瘤、癌變1例（此例為瘤和癌都含有的病例，取樣點(diǎn)經(jīng)病理確認(rèn)為癌變組織）。每例癌和癌旁組織各一個(gè)點(diǎn)，共180個(gè)點(diǎn)。

90例患者術(shù)前均未接受化療放療，其中男67例，女21例，年齡44～86歲，平均年齡67.3歲。病理分級(jí)：Ⅰ、Ⅱ級(jí)28例，Ⅲ級(jí)61例；腫瘤直徑：＞5 cm 47例，≤5 cm 40例；胃癌轉(zhuǎn)移64例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移24例；TNM分期：TNM1、TNM2共33例，TNM3、TNM4共48例；手術(shù)時(shí)間在2009年12月至2010年6月，隨訪至2016年6月，隨訪期間死亡病例60例，生存病例30例；其中缺失的病例為資料不詳?shù)牟±?/p>

人胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901由江蘇大學(xué)朱偉教授贈(zèng)予。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（以色列 BI公司）；兔抗人URI單克隆抗體（美國(guó) Proteintech公司）；小鼠／兔IgG-SABC免疫組化染色試劑盒（SA 1020）、DAB顯色試劑盒（AR1022）和 Mayor's蘇木素（AR0005）購(gòu)自武漢博士德生物公司；Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)QIAGEN公司）；URI siRNA-A片段（前期從siRNAA、siRNA-B、siRNA-C中篩選出來(lái)的干擾效果最好的片段）、無(wú)關(guān)序列片段（蘇州吉瑪公司）；順鉑（美國(guó)Selleckchem公司）；流式細(xì)胞儀、FITC Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）；兔抗人GAPDH抗體（蘇州睿瀛公司）；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（美國(guó)CST公司）；熒光定量PCR試劑盒、熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Gene公司）。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片URI檢測(cè) 采用辣根過(guò)氧化物酶法進(jìn)行組織芯片免疫化學(xué)染色，主要步驟：60℃烤片；二甲苯及梯度乙醇脫蠟；枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)；3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；5%BSA封閉液37℃濕盒封閉；4℃濕盒一抗孵育過(guò)夜；37℃濕盒二抗孵育；SABC放大；DAB顯色，見(jiàn)明顯棕色即終止；蘇木素復(fù)染；脫水；中性樹(shù)脂立即封片。

組織芯片中URI的表達(dá)量由病理學(xué)專家在未知URI蛋白性質(zhì)的情況下盲法進(jìn)行鏡檢分析獲得，高倍鏡（400×）下每個(gè)組織點(diǎn)隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)目標(biāo)細(xì)胞并評(píng)分，胃癌組織中選取上皮組織癌細(xì)胞計(jì)數(shù)，癌旁組織中選取正常上皮和良性腺瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別判讀URI的胞質(zhì)、胞核染色的染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性率。細(xì)胞染成淡黃色至棕黃色即判斷為陽(yáng)性，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分；1+為1分；2+為2分；3+為3分。染色陽(yáng)性率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分，1% ～25%為1分；26% ～50%為 2分；51%～75%為3分；76%～100%為4分。最后以“染色強(qiáng)度評(píng)分”和“染色陽(yáng)性率評(píng)分”的乘積為總評(píng)分進(jìn)行分組，胞質(zhì)表達(dá)總評(píng)分≤6為低表達(dá)組，總評(píng)分＞6為高表達(dá)組；胞核表達(dá)總評(píng)分≤0為低表達(dá)組，總評(píng)分＞0為高表達(dá)組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞 MGC-803和 SGC-7901在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，將細(xì)胞分為空白組、無(wú)關(guān)序列組和siRNA URI干擾組，待細(xì)胞融合率達(dá)70%左右時(shí)，無(wú)關(guān)序列組和siRNA URI干擾組經(jīng)Opti-MEM與Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑混合物分別轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列片段和URI siRNA-A干擾片段，空白組加入等體積Opti-MEM培養(yǎng)基，混勻后置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h或48 h后提取RNA或蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞URImRNA表達(dá)量 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收取各組細(xì)胞，按照RNA提取步驟提取RNA，紫外分光法測(cè)定RNA濃度，根據(jù)RNA濃度計(jì)算出逆轉(zhuǎn)錄所需RNA體積，DNA酶處理后以25℃5 min，42℃30 min，85℃5min反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將含有2μL cDNA的20μL逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃熱啟動(dòng)3 min，95℃變性10 s，56℃退火延伸30 s，其中變性和退火延伸共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性由溶解曲線判定，相對(duì)定量分析采用2-△△CT法分析。每次實(shí)驗(yàn)取3個(gè)復(fù)孔平均值，取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行分析，并繪制柱狀圖。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)URI蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加入提前配制的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，測(cè)定濃度；加入5×上樣緩沖液和β-巰基乙醇混合物煮沸變性，置于-20℃保存。配制10%聚丙烯酰胺凝膠；提取的蛋白以70 V電泳至標(biāo)準(zhǔn)參照物分開(kāi)后，再以100 V電泳至結(jié)束；4℃條件下350 mA恒流電轉(zhuǎn)膜90 min；5%脫脂牛奶封閉1 h；加入兔抗人URI抗體（1∶1 000）和兔抗人GAPDH抗體（1∶3 000），4℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜15 min，重復(fù)3次；加入兔二抗（1∶5 000），37℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15 min；ECL顯影凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期兩類胃癌細(xì)胞接種于6孔板，分別設(shè)定空白組、siRNA URI干擾組以及順鉑處理的未轉(zhuǎn)染組、無(wú)關(guān)序列組、siRNA URI干擾組，待細(xì)胞融合率達(dá)50%～70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后加入含順鉑的培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)我們選擇在細(xì)胞多數(shù)存活的情況下能導(dǎo)致細(xì)胞DNA最大限度損傷的順鉑濃度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，MGC-803細(xì)胞為 10μmol／L、SGC-7901細(xì)胞為5μmol／L，作用12 h。

胰酶消化細(xì)胞收集于EP管，PBS洗滌細(xì)胞，取約1×106個(gè)細(xì)胞，重懸于1 mL 1×結(jié)合緩沖液中，混勻后取100μL細(xì)胞至流式管中，依次加入5μL FITC AnnexinV和PI，室溫避光孵育15 min，檢測(cè)前每管中加入400μL 1×結(jié)合緩沖液，以陽(yáng)性單染細(xì)胞作為對(duì)照，1 h內(nèi)檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)配對(duì)非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn)法分析URI在癌及癌旁組織間的表達(dá)差異；URI的表達(dá)與臨床特征間關(guān)系的分析采用Fisher確切概率法；生存率比較采用log-rank檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)分析采用Levene進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，則用單向方差分析，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)行兩兩之間比較，兩兩之間比較采用Bonferroni進(jìn)行校正，否則用非參數(shù)分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 URI在胃癌組織的表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系

由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中脫片、取材等因素的影響，芯片中6例組織點(diǎn)無(wú)法判讀，最終結(jié)果由84例病例共168個(gè)點(diǎn)判讀統(tǒng)計(jì)所得。90例中6例癌和癌旁共12個(gè)點(diǎn)被排除，包括 A1，E3，F(xiàn)5，A9，H15，J13點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的癌旁點(diǎn)（圖1）。

圖1 胃癌組織芯片判讀范圍

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，URI在胃癌組織細(xì)胞胞質(zhì)中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（P＜0.05），胃癌組織細(xì)胞胞核URI染色總評(píng)分均值比癌旁組織高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1和圖2。

表1 URI在胃癌及癌旁組織表達(dá)的差異性n＝84

進(jìn)一步分析顯示，URI在胃癌組織細(xì)胞胞質(zhì)中的表達(dá)與患者性別相關(guān)（P＜0.05），而與年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)、有無(wú)轉(zhuǎn)移及TNM分期等無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表2。采用log-rank檢驗(yàn)對(duì)胃癌患者URI高、低表達(dá)組間的生存率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，胃癌組織胞質(zhì)（χ2＝1.888，P＞0.05）及胞核（χ2＝3.587，P＞0.05）URI高、低表達(dá)組間患者生存率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 胃癌及癌旁組織URI的IHC染色（×400）

表2 胃癌組織URI表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.2 URI基因敲低細(xì)胞株的驗(yàn)證

qRT-PCR結(jié)果顯示，URI siRNA-A片段轉(zhuǎn)染24 h后，兩種細(xì)胞株URImRNA的表達(dá)較無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組顯著降低（P＜0.01，圖3A）；蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，URIsiRNA-A片段轉(zhuǎn)染48 h，細(xì)胞URI蛋白的表達(dá)顯著低于無(wú)關(guān)序列組（P＜0.01，圖3B）。以上結(jié)果表明URI基因敲低表達(dá)的兩類胃癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.3 敲低URI促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在MGC-803（圖4）和SGC-7901（圖5）兩株細(xì)胞中，未經(jīng)順鉑處理時(shí)，URI siRNA組細(xì)胞凋亡率與空白組相比無(wú)顯著性差異；經(jīng)順鉑誘導(dǎo)后，URIsiRNA組相較于無(wú)關(guān)序列組凋亡比例（早期凋亡+晚期凋亡）明顯增加（P＜0.01）。

圖3 兩類胃癌細(xì)胞URIm RNA和蛋白的表達(dá)

圖4 URI對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞凋亡的影響

圖5 URI對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

哺乳動(dòng)物的URI高度保守，廣泛存在于細(xì)胞胞質(zhì)、胞核和線粒體中［5，13］，并參與組成多種蛋白復(fù)合物［4，14］。目前認(rèn)為URI參與了營(yíng)養(yǎng)敏感的mTOR通路的調(diào)節(jié)，但對(duì)其與疾病的關(guān)系所知甚少。最早基于卵巢癌和肝癌的研究提示URI是一個(gè)癌基因［8-9］。我們參與了肝癌的研究［9］，此后我們對(duì)宮頸癌和胃癌細(xì)胞的研究也支持URI具有癌蛋白性質(zhì)［12，15-16］。原癌基因的擴(kuò)增或表達(dá)活性的增強(qiáng)是癌基因活化的一種機(jī)制，本研究中我們發(fā)現(xiàn)URI在胃癌組織細(xì)胞胞質(zhì)中的表達(dá)明顯增加，提示URI同胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。真核細(xì)胞中普遍存在PI3K／AKT／mTOR通路，該通路的活化狀態(tài)影響細(xì)胞多種重要生理過(guò)程，AKT磷酸化后作用于多種下游底物，包括 mTOR、survivin、Bcl-2、BAD等，影響細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、增殖、凋亡及細(xì)胞周期等［17］。URI是mTOR信號(hào)通路的磷酸化的靶，參與了對(duì)雷帕霉素敏感的信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)URI在卵巢癌高表達(dá)，并通過(guò)抑制PP1γ的活性，持續(xù)活化mTOR下游通路，并通過(guò)負(fù)反饋系統(tǒng)增強(qiáng)S6K1的生存信號(hào)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生存，抑制凋亡［8］。mTOR感受營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用主要在胞質(zhì)中進(jìn)行，因此我們推測(cè)URI主要在胞質(zhì)中與mTOR通路相互作用，而不是作為轉(zhuǎn)錄因子在胞核中發(fā)揮作用。

URI的高表達(dá)同患者生存期及年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)、轉(zhuǎn)移、TNM分期等沒(méi)有顯著相關(guān)性，提示URI可能主要涉及胃癌的發(fā)生機(jī)制而不影響胃癌預(yù)后。而胃癌組織胞質(zhì)URI的表達(dá)在男女性之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其意義有待進(jìn)一步研究。Tummala等［10］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)URI參與了肝癌發(fā)生機(jī)制。持續(xù)表達(dá)外源性URI的小鼠在8周時(shí)出現(xiàn)不同程度肝纖維化，24～54周時(shí)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的腺瘤和早期肝癌，但在第8周停止小鼠URI表達(dá)后小鼠肝纖維化減輕，同時(shí)肝癌的形成受到抑制，表明URI的持續(xù)表達(dá)可促進(jìn)癌前病變和早期肝癌的發(fā)生。

原癌基因激活后可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。其中Bcl-2是重要的抑凋亡基因，而B(niǎo)ax的激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在凋亡信號(hào)刺激下，凋亡通路的Caspase-3激活，切割聚腺苷二磷酸 核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP），誘發(fā)凋亡。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)在多柔比星作用下，URI能增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)并降低Bax的水平，并能增加 Cleaved Caspase-3和 Cleaved PARP-1的水平［12］。順鉑是胃癌化療常用藥物，其導(dǎo)致的DNA雙鏈和單鏈斷裂將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通常各種因素導(dǎo)致的DNA損傷將激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，使細(xì)胞阻滯在G1期，以便修復(fù)DNA損傷，如損傷不能修復(fù)，細(xì)胞將發(fā)生凋亡［18］。如果受損細(xì)胞不能經(jīng)凋亡清除，DNA損傷的積累有可能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化形成腫瘤。我們通過(guò)在兩株胃癌細(xì)胞中敲低URI的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)URI也能夠抑制順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步顯示URI可能通過(guò)抑制或減少細(xì)胞凋亡參與了胃癌的發(fā)病。

我們將在后續(xù)研究中通過(guò)建立胃癌動(dòng)物模型，進(jìn)一步深入探索URI在胃癌發(fā)病中的作用機(jī)制。