李艷暉，劉妙玲，呂思慧，蘇晗濤，孫海燕

（深圳職業(yè)技術學院應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055）

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，且具有相當高的致死率?！?014年世界癌癥報告》表明，在所有癌癥中結直腸癌的全球病發(fā)率居第3位［1］。而富含飽和脂肪酸的飲食結構是導致結直腸癌的重要因素之一［2］。目前臨床針對結直腸癌的治療多以手術和傳統(tǒng)化學合成藥物為主的綜合治療，盡管治療手段取得一定突破，但治療后患者生存率仍較低，且治療藥物存在副作用大、非特異性強、耐藥等問題，發(fā)現(xiàn)作用于特定靶點的高效、低毒、特異性強的新型抗結直腸癌藥物是目前藥物研究發(fā)展的重要方向。已有研究發(fā)現(xiàn)，在天然植物的提取成分中發(fā)現(xiàn)了酚酸等物質能阻止結直腸癌的前驅病變異常隱窩灶的形成［3］。茶葉作為一種天然植物，在世界各地人民的飲食習慣中十分普遍，其抗癌作用也受到人們的關注。

茶多酚是茶葉浸出物中含量高的抗氧化物質。細胞和動物試驗研究均表明，茶多酚能夠有效降低腫瘤發(fā)生率、抑制腫瘤細胞增殖以及促進腫瘤細胞凋亡［4-8］。但茶多酚是否具有抗結直腸癌作用目前尚無定論。另外，人們按茶葉加工發(fā)酵的方式與程度劃分成不發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶、全發(fā)酵茶，不同發(fā)酵程度茶浸提液主要功能性成分含量差異較大［9］，且有研究表明不同加工形式茶葉中茶多酚等功能性成分含量和抗氧化活性有相關性［9-10］。但有關不同發(fā)酵程度茶葉中茶多酚對結直腸癌細胞作用方面的研究目前尚無報道。為研究不同發(fā)酵程度茶葉中茶多酚提取物對結直腸癌細胞的影響，本研究采用未發(fā)酵茶（黃山毛峰）、半發(fā)酵茶（大紅袍）、全發(fā)酵茶（祁門紅茶），探究不同發(fā)酵程度茶葉中的茶多酚提取物對結直腸癌HCT116細胞增殖的影響，以期拓寬茶葉用途、為其作為天然藥物治療癌癥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人結直腸癌細胞株HCT116由廣東省胃腸病學研究所（廣東省結直腸盆底疾病研究重點實驗室）劉煥亮教授課題組贈送；黃山毛峰、大紅袍、祁門紅茶（屬二級茶葉，分別烘干、打粉、過孔徑0.18 mm篩，自封袋封好放干燥器中避光備用。

供試藥劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、Penicillin-Streptomycin雙抗、澳洲特級胎牛血清（FBS）、0.05%Trypsin-EDTA（1X）（美國GIBCO公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），MTS（Promega公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器設備包括：HERAcell240型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），多功能酶標儀SpectraMax? M5e（ 美 國 Molecular Devices），LeicaDMIRB倒置生物熒光顯微鏡（德國Leica公司），5430-R低溫高速離心機、5810-R低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），SWCJ-2FD型潔凈工作臺（蘇州蘇凈集團安泰公司），全自動手持式細胞計數(shù)器Scepter?、細胞計數(shù)芯片 Scepter? Sensors-60μm（美國Millipore公司），25 cm2細胞培養(yǎng)瓶、96-well細胞培養(yǎng)板（透明）、15 mL離心管、50 mL離心管、0.45 μm濾膜、1.5 mL EP離心管（美國Corning Costar公司），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），EPED-E2-20TS型實驗室級超純水器（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)條件 從液氮罐中取出冷凍管，迅速放進37℃水浴溶解，然后在無菌條件下將細胞轉移到1.5 mL EP離心管，600 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 mL RPMI-1640培養(yǎng)液（內(nèi)含10%胎牛血清和1%雙抗，下同）重懸細胞，加入4～5 mL RPMI-1640培養(yǎng)液和1 mL重懸細胞液于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2恒溫箱靜置培養(yǎng)。

人結直腸癌細胞株HCT116，體外培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%,胎牛血清、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素），置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。

12.2 茶多酚提取方法 取20 g已處理的茶葉粉末，加入500 mL 70%甲醇，冷凝回流浸提30 min（重復浸提3次），合并濾液，將其旋轉蒸發(fā)至原體積的15%～20%，然后用3倍體積氯仿萃取1次，再次旋轉蒸發(fā)，將其旋轉蒸發(fā)至萃取后體積的5%左右，剩余部分溶解于超純水中。15 000 r/min離心20 min，取上清液，真空冷凍干燥，常溫避光保存。

1.2.3 茶多酚提取物總多酚含量測定 總多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法［11］，以沒食子酸為標準品，用分光光度計進行測定。分別精確稱取所提取的黃山毛峰、大紅袍、祁門紅茶茶多酚粗粉適量，定容至合適體積。取100 μL樣品（可作適當稀釋）和400 μL超純水，加入0.1 mL福林酚試劑混勻后，靜置6 min。根據(jù)沒食子酸標準曲線回歸方程計算待檢樣品中酚類物質的含量，茶多酚含量以每克茶多酚粗粉中所含的沒食子酸當量（mg /g，DW）表示。每個樣品3次重復。

1.2.4 HCT116細胞存活率測定 采用MTS還原反應測定HCT116細胞的存活率。取對數(shù)生長期的人結直腸癌細胞株HCT116胰酶消化后，人結直腸癌細胞HCT116培養(yǎng)液重懸，取2.5×105個細胞，調整濃度為5×104個/mL，以100 μL/孔接種于96孔板孔內(nèi)。各處理分別加入5、15、25、35 μg/mL濃度梯度的3種茶多酚于HCT116細胞中，每個濃度處理3次重復；空白對照（無接種細胞）、對照（有接種細胞）各加入不含茶多酚的等體積無血清無雙抗的細胞培養(yǎng)液；置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后避光，每孔各加入10 μL MTS孵育，4 h后用酶標儀在490 nm波長處檢測吸收度（A）值，計算抑制率并用Graphpad Prism 5.0軟件計算藥物處理細胞后達半數(shù)抑制的藥物濃度IC50。

1.2.5 細胞形態(tài)學觀察 將對照及藥物處理72 h后的細胞置于LeicaDMIRB倒置生物熒光顯微鏡的10倍光學顯微鏡下，進行細胞形態(tài)觀察和比較。選取對照、15 μg/mL、35 μg/mL等3個茶多酚濃度的細胞進行觀察并拍照。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析［5］。

2 結果與分析

2.1 茶多酚提取物總多酚含量測定

根據(jù)標準曲線計算得出，黃山毛峰、大紅袍、祁門紅茶茶多酚提取物中總多酚含量分別為434.11（±8.76）、401.94（±2.90）、282.19（±6.47 ）mg GAE/g。

2.2 不同發(fā)酵程度茶葉茶多酚對HCT116細胞增殖的影響

從表1可以看出，當黃山毛峰茶多酚提取物濃度在5～25 μg/mL范圍時，HCT116細胞抑制率隨著其濃度的上升而上升，且與對照相比差異極顯著，說明黃山毛峰茶多酚提取物對結直腸癌HCT116細胞增殖有明顯的抑制作用，且作用強度隨濃度的增大而增大；茶多酚提取物濃度為25 μg/mL時，HCT116細胞的抑制率最大（73.66%，P＜0.01），抑制效果顯著。當大紅袍茶多酚提取物濃度在5～35 μg/mL范圍時，HCT116細胞抑制率隨著其濃度的上升而上升，且與對照相比差異極顯著，表明大紅袍茶多酚提取物對結直腸癌HCT116細胞增殖有明顯的抑制作用，且具有量效相關性；茶多酚提取物濃度為35 μg/mL時，HCT116細胞的抑制率最大（54.65%，P＜0.01），抑制效果明顯。祁門紅茶茶多酚提取物濃度在5～35 μg/mL范圍時，HCT116細胞出現(xiàn)不同程度的抑制，與對照比較差異顯著，表明祁門紅茶茶多酚提取物處理HCT116細胞72 h后呈現(xiàn)一定量效相關性；茶多酚濃度為35 μg/mL時，HCT116細胞的抑制率最大（55.05%，P＜0.01），具有一定抑制效果。

表1 3種茶葉茶多酚提取物對HCT116細胞的抑制率（%）

濃度在5～35 μg/mL范圍時，3種不同發(fā)酵程度茶葉中的茶多酚提取物均對HCT116細胞的增殖有顯著抑制作用。從圖1可以看出，黃山毛峰、大紅袍、祁門紅茶茶多酚提取物作用HCT116細胞72 h的IC50分別是11.86、21.46、30.96 μg/mL，處理間差異顯著。3種茶多酚提取物對HCT116細胞作用的IC50值大小比較如下：未發(fā)酵茶黃山毛峰茶多酚提取物IC50＜半發(fā)酵茶大紅袍茶多酚提取物IC50＜全發(fā)酵茶祁門紅茶茶多酚提取物IC50。表明隨著茶葉發(fā)酵程度的增加，對HCT116細胞增殖的抑制作用減弱。

圖1 不同茶葉茶多酚提取物作用HCT116細胞72 h后的IC50值

2.3 細胞形態(tài)學觀察不同發(fā)酵程度茶葉茶多酚對HCT116細胞的抑制作用

從圖2可以看出，黃山毛峰對照的細胞貼壁生長，生長狀態(tài)良好，透明度大，折光性強，且細胞數(shù)量較多；15 μg/mL黃山毛峰茶多酚提取物處理后的細胞，相較于對照來說，有少數(shù)的細胞萎縮變圓，有凋亡小體出現(xiàn)；35 μg/mL黃山毛峰茶多酚提取物處理后的細胞，生長狀況差，折光性弱，絕大部分貼壁細胞皺縮成圓形，細胞間質消失，凋亡小體增多，細胞數(shù)量大幅減少，與對照相比有顯著差異。大紅袍茶對照的細胞生長狀態(tài)良好，細胞較密集；15 μg/mL大紅袍茶多酚提取物處理后的細胞，相較對照有少數(shù)細胞皺縮成圓形，出現(xiàn)凋亡小體，細胞數(shù)量相對減少；35 μg/mL大紅袍茶多酚提取物處理后的細胞大部分皺縮、變圓，體積縮小，細胞不連成片狀，細胞大量減少，與對照相比有明顯差異。祁門紅茶對照細胞處于貼壁生長狀態(tài)，呈現(xiàn)無色透明，連成片狀且細胞較密集；15 μg/mL祁門茶多酚提取物處理后的細胞，出現(xiàn)少量細胞皺縮，變圓，細胞數(shù)量相對減少；35 μg/mL祁門茶多酚提取物處理后的細胞皺縮，變圓，體積縮小，細胞數(shù)量減少。

圖2 不同茶葉茶多酚提取物作用72 h后的HCT116細胞（10×10）

可見，在35 μg/mL的相同濃度下，不同發(fā)酵程度茶葉茶多酚提取物對細胞形態(tài)影響程度不同。黃山毛峰和大紅袍茶多酚提取物處理后的細胞數(shù)量相較對照組明顯減少，貼壁細胞形態(tài)大多數(shù)皺縮、變圓，生長狀況差，折光性差，產(chǎn)生大量凋亡小體。祁門紅茶茶多酚提取物處理后的細胞相較上述兩組，數(shù)量減少程度最小，形態(tài)改變程度最小。

3 結論與討論

茶多酚是茶葉中最主要的活性成分，包括兒茶素、黃酮類、酚酸類、花青素等。其中兒茶素類化合物是茶多酚的主要成分，約占茶多酚總量的70%～80%，主要含有兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子酸兒茶素（EGC）以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）等多種活性物質［12］。雖然在不同種類茶葉中，茶多酚類物質均為主要化學成分［13］，但不同品種、不同產(chǎn)地、不同品質茶葉中茶多酚提取物的含量、組成成分卻有較大區(qū)別［14-16］。茶葉加工方式，尤其是發(fā)酵過程會對茶葉茶多酚組成成分產(chǎn)生極大影響［17］。茶多酚提取物的活性作用主要是由不同構成成分綜合作用的結果［18-19］。本研究對黃山毛峰、大紅袍、祁門紅茶茶多酚提取物中的總多酚含量進行了測定，結果表明，經(jīng)半發(fā)酵工藝處理后的大紅袍和全發(fā)酵工藝處理后的祁門紅茶，其茶多酚提取物中的總多酚含量相較未發(fā)酵的黃山毛峰茶多酚提取物中的總多酚有不同程度的下降，且發(fā)酵程度越高，總多酚含量下降越多。推測可能與茶葉在發(fā)酵過程中，多酚類物質發(fā)生氧化、聚合生成茶黃素、茶紅素等其他物質［20］，導致多酚含量下降有關。

本研究MTS試驗結果表明，黃山毛峰、大紅袍、祁門紅茶的茶多酚提取物對HCT116細胞的增殖均有抑制效果。且在特定濃度范圍內(nèi)，3種茶葉茶多酚提取物對HCT116細胞作用的IC50值有顯著差異，且發(fā)酵程度越高的茶葉提取物對HCT116細胞作用的IC50值越高，抑制效果越小。3種茶葉茶多酚對HCT116的抑制作用與茶多酚提取物中總多酚含量具有一定的量效關系。已有研究表明，綠茶在貯藏過程中茶多酚和黃酮含量的減少與抗氧化活性的降低趨勢具有很好的對應關系［21］，這也與本研究結果一致。同時，本研究進一步證實了茶多酚是茶葉中主要抗癌活性成分［22］，且茶葉在不同發(fā)酵工藝過程中，引起了多酚氧化酶活性的改變，進而影響到茶多酚氧化聚合反應機制，促使茶葉內(nèi)多酚類物質含量、組成成分、分子結構等的改變，從而產(chǎn)生不同的生理活性［23］。本研究中3種不同發(fā)酵程度茶葉茶多酚表現(xiàn)出的不同抑癌效果可能也與此有關。

通過細胞形態(tài)觀察，在特定濃度條件下，黃山毛峰茶多酚提取物和大紅袍茶多酚提取物作用HCT116細胞后，細胞生長狀況發(fā)生明顯改變，貼壁細胞皺縮、變圓，凋亡小體增多，折光性差。祁門紅茶茶多酚提取物作用后，細胞也出現(xiàn)一定程度凋亡特征，但相較前兩種茶多酚提取物形態(tài)改變程度小，這也進一步證實了MTS試驗結果。