陶曉靜，楊鵬，沈鳳，顏淵鴛，李丹，羅雪蘭，甘娜，覃裕旺，歐和生,

(1廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院)

微小RNA(miRNA)是一類含21～28個核苷酸的單鏈保守內(nèi)源性非編碼RNA。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過與信使RNA(mRNA)結(jié)合降解mRNA或抑制其翻譯來調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與組織細(xì)胞的正常生理功能，調(diào)控某些疾病如腫瘤、心血管疾病的病理生理過程[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞 (vascular endothelial cells, VECs) 功能紊亂是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的起始環(huán)節(jié)。研究[2]發(fā)現(xiàn)，miRNA參與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化與凋亡等功能調(diào)節(jié)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, hUCMSCs)具有多向分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等[3]。血管生成是一個復(fù)雜的過程，其中涉及干細(xì)胞定向內(nèi)皮分化。miRNA在干細(xì)胞定向內(nèi)皮分化過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。我們的前期研究[5]證實，27nt-miRNA與轉(zhuǎn)錄因子共同參與調(diào)控其宿主基因內(nèi)皮型一氧化氮合酶( endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達(dá)，進(jìn)而影響VECs的增殖、遷移和管腔形成能力。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)定向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化后eNOS的表達(dá)/活性增加，血管活性分子一氧化氮(nitric oxide，NO)合成與釋放增加[6]。因此，27nt-miRNA是否通過調(diào)控eNOS表達(dá)影響hUCMSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程及分化后細(xì)胞的成管能力，值得關(guān)注。2017年10月08日～2018年4月25日，我們通過構(gòu)建27nt-miRNA高表達(dá)質(zhì)粒，慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染hUCMSCs，觀察其對hUCMSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化及對分化后細(xì)胞管腔形成能力的影響，并探討相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 hUCMSCs。血清替代品，培養(yǎng)基，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (bFGF)，慢病毒GV367載體及AgeI / NheI酶，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，總RNA提取試劑盒(TRIzol 法)，eNOS兔源單克隆抗體，羊抗兔IgG-HRP，NO含量測定試劑盒，人工基底膜(Matrigel)。倒置顯微鏡，酶聯(lián)免疫檢測儀Model-450，Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)Fluor Chem HD2。

1.2 目的基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及慢病毒包裝 委托上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司根據(jù)來源于eNOS基因第4內(nèi)含子中的27堿基重復(fù)序列即27nt-miRNA序列5′-GAAGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3′ 、27nt-miRNA反義序列及隨機(jī)對照序列5′-GUCAUCAGUCGAGCUAGACGAG-3′分別設(shè)計27nt-miRNA過表達(dá)、27nt-miRNA抑制物(anti-27nt-miRNA)及對照基因片段。采用PCR技術(shù)獲取目的基因，通過基因重組技術(shù)(AgeI / NheI 酶切)將目的基因分別克隆到GV367慢病毒載體中，進(jìn)行PCR鑒定及DNA測序比對分析，構(gòu)建相應(yīng)的27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及對照慢病毒載體。載體含有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)及嘌呤霉素，轉(zhuǎn)染成功的hUCMSCs可用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.3 hUCMSCs轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)定向內(nèi)皮細(xì)胞分化 將hUCMSCs用含2%血清替代品、2%谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代。選擇生長狀態(tài)良好的第3～5代hUCMSCs用于轉(zhuǎn)染。hUCMSCs消化、離心，棄上清后用完全培養(yǎng)基重懸，制備3×104/mL的細(xì)胞懸液，取2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板，過夜培養(yǎng)約24 h。鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，穩(wěn)定后分為27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組，分別轉(zhuǎn)染27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及對照慢病毒載體：首先根據(jù)預(yù)實驗確定的慢病毒轉(zhuǎn)染條件及感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection, MOI)=70，配制增強(qiáng)液(ENi.S.)1 mL/孔，Polybrene 5 μg/mL，根據(jù)三種病毒的滴度及公式[病毒體積=(MOI×細(xì)胞數(shù)目)/病毒滴度]來配置三組轉(zhuǎn)染液。棄去原培養(yǎng)液，PBS清洗2次后，每孔分別依次加入1 mL轉(zhuǎn)染液，放回培養(yǎng)箱孵育8～12 h(過程中注意觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)生變化可提前換液)，更換為2 mL完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染48 h后，更換含濃度為8 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選。轉(zhuǎn)染約72 h，換液棄去因未轉(zhuǎn)染被嘌呤霉素殺死的細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果(觀察細(xì)胞的綠色熒光效率及強(qiáng)度)。轉(zhuǎn)染成功后分別將三組細(xì)胞消化收集，以2×104/孔接種于6孔板中，三組細(xì)胞每孔均用2 mL含有1%血清替代品、1%谷氨酰胺、20 ng/mL的VEGF及10 ng/mL的b-FGF培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，隔天半量換液，誘導(dǎo)9 d。鏡下觀察分化期間細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.4 各組細(xì)胞增殖能力觀測 采用MTT法。各組轉(zhuǎn)染并誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞分別以每孔 5×103個接種到 96孔板，待細(xì)胞達(dá)到50%融合時更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h(實現(xiàn)細(xì)胞同步生長)，每孔加10 μL的 MTT繼續(xù)孵育4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入 100 μL的二甲基亞砜，震蕩15 min。酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm的波長下測定光密度值(OD值)，以此代表細(xì)胞增殖能力。

1.5 各組細(xì)胞上清液NO檢測 采用硝酸還原酶法。 在誘導(dǎo)hUCMSCs分化過程中，分別吸取各組第1、3、5、7、9天的培養(yǎng)基上清，3 500 r/min離心10 min，-80 ℃凍存，檢測前37 ℃水浴快速融化，按試劑盒說明書步驟逐一進(jìn)行，最后使用酶聯(lián)免疫檢測儀在550 nm波長測定各組的OD值。根據(jù)測得的OD值計算各組各時間點(diǎn)的NO濃度：NO濃度(μmol/L)=(測定管OD值-空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(100 μmol/L)×稀釋倍數(shù)。

1.6 各組細(xì)胞管腔形成能力觀測 采用Matrigel實驗。實驗前將Matrigel置于4 ℃解凍，在冰上按17～20 μL/孔將其均勻鋪于96孔板(注意不要有氣泡)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中放置1 h。各組細(xì)胞消化后，無血清培養(yǎng)基重懸，1×104/孔分別種于鋪好的Matrigel上，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，鏡下觀察管腔形成情況。

1.7 各組細(xì)胞的eNOS mRNA檢測 采用RT-PCR技術(shù)。按TRIzol試劑盒逐步、分別提取每組細(xì)胞的總RNA。Primer 5.0軟件設(shè)計、合成人eNOS引物序列，上游引物序列為5′-AGGAACCTGTGTGACCCTCA-3′，下游引物序列為5′-CGAGGTGGTCCGGGTATCC-3′，GAPDH作內(nèi)參。先將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，經(jīng)擴(kuò)增反應(yīng)，取8 μL的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描、計算灰度值，以eNOS灰度值/GAPDH灰度值表示eNOS mRNA的相對表達(dá)量。

1.8 各組細(xì)胞的eNOS 蛋白檢測 ①免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組細(xì)胞的eNOS 蛋白：將已轉(zhuǎn)染的各組hUCMSCs制成均勻的細(xì)胞懸液，以2×104/孔接種于預(yù)先放置在6孔板內(nèi)的玻片上，用含1%血清替代品、1%谷氨酰胺、20 ng/mL 的VEGF及10 ng/mL的 b-FGF培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。待分化第9天，細(xì)胞長滿約80%后，PBS洗滌2次，2 mL的 4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min后取出玻片晾干。將1滴樹脂滴于載玻片上，將細(xì)胞玻片無細(xì)胞面緊貼樹脂固定，晾干待用。首先，用0.5% TritonX-100處理30 min，PBS洗滌2次；3% H2O2溶液處理10 min，PBS洗滌2次；5% BSA室溫封閉30 min，PBS洗滌2次。接著eNOS一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌2次后，加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌2次。最后DAB室溫顯色10 min，蘇木素復(fù)染，烘干后封片，鏡下觀察eNOS表達(dá)情況。②Western Blotting檢測各組細(xì)胞的eNOS 蛋白:用細(xì)胞裂解液RIPA裂解分化后的各組細(xì)胞，于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度。各組分別取蛋白40 μg ，8% SDS-PAGE 上樣、電泳分離后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。5% BSA室溫封閉1 h，加入eNOS一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜。TBST 緩沖液洗膜3次，各10 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫條件下孵育2 h后用TBST 緩沖液洗滌3次，各10 min。A、B化學(xué)發(fā)光檢測試劑按1∶1配制混合溶液，與膜反應(yīng) 2 min。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)曝光、顯影、分析蛋白電泳條帶的灰度值。GAPDH為內(nèi)參。eNOS蛋白的相對表達(dá)量=eNOS灰度值/GAPDH灰度值。

2 結(jié)果

2.1 27nt-miRNA慢病毒轉(zhuǎn)染效率及其對hUCMSCs分化形態(tài)的影響 各組27nt-miRNA慢病毒轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到90%以上，見圖1A。三組hUCMSCs轉(zhuǎn)染后經(jīng)同一條件誘導(dǎo)分化，結(jié)果見圖1B;對照組細(xì)胞亮度增強(qiáng)，觸角縮短，部分細(xì)胞呈多角形，出現(xiàn)內(nèi)皮樣形態(tài)改變；27nt-miRNA組細(xì)胞分化不明顯，細(xì)胞體積較大，呈紡錘形，生長速度較慢，細(xì)胞數(shù)目較少，未形成管腔結(jié)構(gòu)；anti-27nt-miRNA組少數(shù)細(xì)胞稍細(xì)長，呈短梭形，細(xì)胞間伸出偽足相連逐漸形成一個或半個管腔結(jié)構(gòu)，管腔周圍細(xì)胞呈鋪路石樣排列。

圖1 27nt-miRNA慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果及hUCMSCs分化形態(tài)

2.2 27nt-miRNA對hUCMSCs分化后細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組OD值分別為0.50±0.03、0.84±0.02、0.68±0.01；與對照組相比，27nt-miRNA組OD值降低26.47%，anti-27nt-miRNA組OD值增加23.53%；與27nt-miRNA組相比，anti-27nt-miRNA組OD值增加68%;組間兩兩相比，P均<0.01。

2.3 27nt-miRNA對hUCMSCs分化過程N(yùn)O產(chǎn)量的影響 細(xì)胞分化第5天，27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的NO含量分別為(121.25±3.71)、(191.37±2.95)、(182.99±9.12)μmol/L；與對照組相比，27nt-miRNA組細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的NO量降低33.74%；與anti-27nt-miRNA組相比，27nt-miRNA組細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的NO量降低36.64%；27nt-miRNA組與anti-27nt-miRNA組、對照組相比，P均<0.05。

細(xì)胞分化第9天，27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的NO分別為(203.89±5.63)、(335.93±9.46)、(306.56±5.21)μmol/L；與對照組相比，27nt-miRNA組細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的NO量降低33.49%；與anti-27nt-miRNA組相比，27nt-miRNA組細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的NO量降低39.31%；27nt-miRNA組與anti-27nt-miRNA組、對照組相比，P均<0.05。

2.4 27nt-miRNA對hUCMSCs分化后細(xì)胞管腔形成能力的影響 與對照組相比，27nt-miRNA組細(xì)胞雖有聚集傾向，但未能形成完整的管腔樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；anti-27nt-miRNA組細(xì)胞所形成的管腔數(shù)目較多，管腔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較小而緊密；見圖2。

圖2 各組hUCMSCs分化后細(xì)胞管腔形成情況

2.5 27nt-miRNA 對各組細(xì)胞eNOS mRNA表達(dá)的影響 27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組細(xì)胞的eNOS mRNA相對表達(dá)量分別為0.48±0.01、0.76±0.02、0.63±0.02；與對照組相比，27nt-miRNA組eNOS mRNA相對表達(dá)量降低23.81%、anti-27nt-miRNA組增加20.63%；與27nt-miRNA組相比，anti-27nt-miRNA組的eNOS mRNA 相對表達(dá)量增加了58.33%；組間兩兩相比，P<0.05或P<0.01。

2.6 27nt-miRNA對各組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)量的影響 27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組細(xì)胞的蛋白相對表達(dá)量分別為0.43±0.03、 0.67±0.03、0.57±0.04；與對照組相比，27nt-miRNA組eNOS蛋白相對表達(dá)量降低24.56%、anti-27nt-miRNA組增加17.54%；與27nt-miRNA組相比，anti-27nt-miRNA組eNOS蛋白相對表達(dá)量增加55.81%；組間兩兩相比，P<0.05或P<0.01。

3 討論

miRNAs是MSCs外泌體中的重要組分，通過調(diào)控MSCs增殖、分化和歸巢，維持干細(xì)胞的基本特征[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，MSCs成骨分化后提取的外泌體中多種miRNA如let-7a、miR-199b、miR-218等的表達(dá)顯著增加，而miR-221、miR-155、miR-885-5p等的表達(dá)顯著降低。此外，有研究[9]發(fā)現(xiàn)miRNA let-7f-5p通過抑制靶標(biāo)Par6α促進(jìn)MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，miR-410通過下調(diào)Wnt3a促進(jìn)MSCs成軟骨分化[10]。令人感興趣的是，miR-126通過激活PI3K / Akt和MAPK / ERK途徑促進(jìn)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，且分化后特異性的內(nèi)皮基因包括VEGF、eNOS，KDR和VE-粘附素表達(dá)顯著增加[11]。這與我們的前期研究即MSCs定向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化后eNOS的表達(dá)/活性增加的結(jié)果相符。eNOS基因第4內(nèi)含子中的27 堿基重復(fù)序列是27nt- miRNA的來源，27nt-miRNA與轉(zhuǎn)錄因子共同參與調(diào)控其宿主基因eNOS的表達(dá)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，27nt-miRNA組hUCMSCs分化程度較低、eNOS mRNA及蛋白表達(dá)降低，而anti-27nt-miRNA組恰好相反，這一結(jié)果強(qiáng)烈提示27nt-miRNA在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)eNOS蛋白表達(dá)，從而抑制hUCMSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化。

在心肌缺血模型中移植過表達(dá)miR-126的MSCs后Dll-4的表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)內(nèi)皮分化、管腔及功能性微血管生成[13]。miR-210通過下調(diào)靶基因Efna3發(fā)揮其調(diào)節(jié)MSCs 向VECs分化作用及促血管生成效應(yīng)[14]。eNOS組織特異性強(qiáng)，高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，其表達(dá)異常與心血管疾病的病理生理過程密切相關(guān)。Xia等[15]研究發(fā)現(xiàn)，eNOS/F92A-Cav1慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs后eNOS蛋白表達(dá)及NO產(chǎn)量增加，上調(diào)的eNOS誘導(dǎo)激活VEGF通路，從而促進(jìn)MSCs成脂、成骨分化和血管生成。本研究結(jié)果表明，27nt-miRNA對hUCMSCs 分化的內(nèi)皮樣細(xì)胞的管腔形成有抑制作用。

正常情況下，為維持血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，血管內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種活性物質(zhì)。其中，NO由eNOS以L-精氨酸為底物催化產(chǎn)生，是調(diào)節(jié)血管舒張的重要因子，在內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成等方面起著重要作用[16]。血管生成是多階段的復(fù)雜過程，與內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)。MSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化，可修復(fù)內(nèi)皮損傷，調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能，促進(jìn)血管生成，可能用于腫瘤、糖尿病并發(fā)癥及心血管相關(guān)疾病的治療。Chen等[17]證實eNOS和MSCs在調(diào)節(jié)心肌梗死后的心臟再生中有協(xié)同作用。該研究認(rèn)為NO濃度的局部升高是激活血管生成的關(guān)鍵因素，此外eNOS也可能通過刺激促血管生成因子的分泌或增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的募集發(fā)揮作用。因此，27nt-miRNA極有可能是通過調(diào)控eNOS/NO通路對細(xì)胞增殖及管腔形成產(chǎn)生調(diào)控作用。

總之，本研究主要有以下三個方面的發(fā)現(xiàn)：27nt-miRNA抑制hUCMSCs分化、增殖，使其不能形成管腔結(jié)構(gòu)；27nt-miRNA對hUCMSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中eNOS mRNA及蛋白表達(dá)有明顯抑制作用；27nt-miRNA明顯抑制hUCMSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中NO的產(chǎn)量。以上發(fā)現(xiàn)提示27nt-miRNA抑制hUCMSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化及管腔形成，而該影響與27nt-miRNA抑制eNOS蛋白表達(dá)有關(guān)。需要指出的是，MSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化及血管生成過程受多種因素調(diào)節(jié)，可能不僅僅受單一miRNA或基因所調(diào)控。27nt-miRNA是否與其他miRNA協(xié)同參與MSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化調(diào)節(jié)，27nt-miRNA對MSCs定向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中eNOS表達(dá)的調(diào)控是否依賴其他因素如轉(zhuǎn)錄因子、VEGF，這些問題有待進(jìn)一步探討。