邵文亞，梁 玉，梁 振*，張麗華，張玉奎

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

蛋白質(zhì)的糖基化作為生物體最重要、最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，在蛋白質(zhì)相互作用、分子識(shí)別、免疫應(yīng)答[1]、信號(hào)傳導(dǎo)[2]等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮了重要作用。生物體內(nèi)糖基化位點(diǎn)以及糖基化水平的異常與多種疾病密切相關(guān)，如腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、神經(jīng)退行性疾病、代謝相關(guān)疾病等[3-4]。目前，已有很多糖蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物或藥物靶標(biāo)用于臨床上疾病的預(yù)警、診斷和治療[5-7]。糖蛋白質(zhì)組學(xué)作為蛋白質(zhì)組學(xué)的重要分支，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域[8]。

糖蛋白質(zhì)是在蛋白質(zhì)的特異氨基酸殘基上通過(guò)共價(jià)鍵方式連接上糖鏈所形成，一般可按糖鏈所連氨基酸殘基以及連接方式的不同將蛋白質(zhì)糖基化分為以下類型：N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化以及糖基化磷脂酰肌醇錨(GPI-anchored)等[9]。其中，N-糖基化是糖鏈還原端的半縮醛羥基通過(guò)N-糖苷鍵連接到蛋白質(zhì)特定氨基酸序列的天冬酰胺殘基(Asparagine，Asn)側(cè)鏈酰胺基上所形成，其特定氨基酸序列是指N-X-S/T/C(X為除了脯氨酸以外的任意氨基酸，S 為絲氨酸，T 為蘇氨酸，C 為半胱氨酸)。在糖鏈組成方面，N-連接糖鏈一般由一個(gè)三甘露糖-殼二糖的核心五糖結(jié)構(gòu)以及若干糖單元組成，根據(jù)糖單元的組成可分為高甘露糖型、復(fù)合型和雜合型3類。N-糖鏈可被肽N-糖苷酶F(Peptide N-glycosidase F,PNGase F)高效、特異性的切除，再加上N-糖基化發(fā)生于特定的氨基酸序列，因此N-糖基化可以依靠質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索手段實(shí)現(xiàn)大規(guī)模位點(diǎn)鑒定，成為目前研究最多的糖基化類型，已有許多規(guī)?；腘-糖基化數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布，但其鑒定數(shù)量?jī)H占理論預(yù)測(cè)的5%～10%。主要原因是糖基化雖然是生物體內(nèi)普遍發(fā)生的一種翻譯后修飾，哺乳動(dòng)物體內(nèi)糖蛋白質(zhì)的比例高達(dá)50%，但其豐度通常較低，且糖基化蛋白質(zhì)酶解肽段中僅有2%～5% 為糖基化肽段，另外在質(zhì)譜中糖肽的離子化效率不高，糖基化蛋白質(zhì)/肽段往往不易被質(zhì)譜所鑒定[10-11]。因此，為實(shí)現(xiàn)糖基化蛋白質(zhì)/肽段的深度覆蓋分析，對(duì)糖基化蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行高選擇性富集對(duì)于糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要意義。本文對(duì)目前N-糖基化蛋白質(zhì)組樣品富集方法的原理、特點(diǎn)以及最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 N-糖基化蛋白質(zhì)組樣品的富集方法

目前，N-糖基化蛋白質(zhì)組樣品的富集方法根據(jù)其富集機(jī)理不同，主要分為凝集素親和法、酰肼化學(xué)法、親水作用色譜法及硼親和法等。

1.1 凝集素親和法

凝集素作為一類非抗體類糖蛋白質(zhì)，具有1個(gè)或多個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠?qū)Ｒ慌c糖蛋白質(zhì)/肽連接的聚糖內(nèi)部或末端某些特定單糖或者寡糖精細(xì)結(jié)構(gòu)特異性地可逆結(jié)合。因此，凝集素可用以捕獲特定的糖蛋白質(zhì)或糖肽，之后再通過(guò)用特定的單糖競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的方式將其洗脫下來(lái)[12-13]。不同的凝集素對(duì)不同類型的糖鏈具有特異性的識(shí)別能力，可以使用單一凝集素對(duì)某特定類型的糖蛋白質(zhì)/糖肽進(jìn)行特異性富集，也可使用多種凝集素(Multi-lectin affinity)[14]，或者連續(xù)凝集素親和層析(Serial lectin affinity chromatography,SLAC)[15]對(duì)樣品中的糖蛋白質(zhì)/糖肽進(jìn)行全譜富集。Mann等[16]將凝集素親和法與濾膜輔助樣品預(yù)處理技術(shù)相結(jié)合，使糖蛋白質(zhì)的富集和酶解同步進(jìn)行，通過(guò)該技術(shù)對(duì)鼠組織及血漿中的 N-糖基化蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定 6 367 個(gè)糖基化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于 2 352 個(gè)糖蛋白質(zhì)。該課題組[17]進(jìn)一步將相對(duì)定量技術(shù)Super-SILAC與上述凝集素富集策略結(jié)合，通過(guò)對(duì)糖基化位點(diǎn)的定量分析，研究了11 種代表乳腺癌不同發(fā)展時(shí)期的細(xì)胞系中分泌蛋白糖基化位點(diǎn)的變化情況，以尋找乳腺癌的疾病標(biāo)志物。Allmaier等[18]將帶有凝集素的磁性納米顆粒用于木霉菌(Trichoderma atroviride)中糖蛋白質(zhì)的富集，之后通過(guò)凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)木霉菌中存在兩個(gè)關(guān)鍵的糖蛋白，該研究首次將凝集素富集方法用于真菌類糖蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。

凝集素親和法操作簡(jiǎn)單，可在糖蛋白和糖肽水平上實(shí)現(xiàn)富集，且能保持糖鏈結(jié)構(gòu)的完整性，對(duì)于研究某些含有特定單糖的糖蛋白(如：唾液酸化或核心巖藻糖化的N-糖基化蛋白質(zhì))具有一定優(yōu)勢(shì)，這些糖基化在某些病理和生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[19-20]。但是，凝集素的親和專一性使大規(guī)模的糖基化富集需要同時(shí)使用多種凝集素，成本較高，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。

1.2 酰肼化學(xué)法

酰肼化學(xué)法是將糖蛋白或糖肽糖鏈上的順式鄰二羥基通過(guò)高碘酸氧化轉(zhuǎn)化為醛基，利用醛基與含有酰肼基團(tuán)的基質(zhì)材料共價(jià)作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖基化蛋白質(zhì)/肽段的選擇性富集[21]。具體過(guò)程如下：首先是氧化反應(yīng)，通過(guò)高碘酸鹽將糖蛋白/肽上糖鏈中的順式鄰二羥基氧化成醛基；其次是共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)生成的醛基與基質(zhì)材料上的酰肼共價(jià)結(jié)合形成腙鍵，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中糖蛋白/糖肽的特異性捕獲；最后是洗脫與酶解，先通過(guò)洗脫液將未發(fā)生共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽段從體系中去除，再利用糖苷酶將N-糖基化蛋白質(zhì)/肽段釋放，進(jìn)而進(jìn)行質(zhì)譜分析。目前，該方法可分為糖蛋白質(zhì)水平的富集及糖肽水平的富集兩種策略。但由于蛋白質(zhì)溶解性差，空間位阻大，后續(xù)需酶解等因素限制，因此基于酰肼化學(xué)的富集方法已逐漸發(fā)展為以糖肽水平的富集策略為主[22-23]。該方法于2003年由Aebersold等[24]首次提出并用于人血漿樣品中糖蛋白的富集，結(jié)合標(biāo)記定量技術(shù)，對(duì)血漿中的N-糖蛋白質(zhì)進(jìn)行了差異分析。該方法已成功應(yīng)用于唾液、細(xì)胞質(zhì)膜、血漿等具有重要生物學(xué)意義樣品中N-糖基化蛋白質(zhì)組的分析與鑒定[25-26]。

酰肼化學(xué)法中糖鏈結(jié)構(gòu)在富集過(guò)程中會(huì)被破壞，且其步驟繁瑣，Zhang等[27]開(kāi)發(fā)了一種可逆酰肼固相萃取的富集策略。過(guò)程如下：首先，糖鏈中的糖環(huán)在苯胺的催化下形成醛的結(jié)構(gòu)；其次，具有酰肼基團(tuán)的固相顆粒與糖鏈的醛基反應(yīng)形成共價(jià)腙鍵捕獲糖蛋白質(zhì)/肽，通過(guò)洗脫液將未與固相顆粒結(jié)合的非糖蛋白質(zhì)/肽洗去，從而實(shí)現(xiàn)糖蛋白質(zhì)/肽的選擇性富集；最后，在pH值約為1.0～2.0的強(qiáng)酸性環(huán)境中腙鍵水解釋放出糖鏈，從而實(shí)現(xiàn)可逆過(guò)程。

酰肼化學(xué)法一般是將酰肼基團(tuán)修飾于固相顆粒表面，利用固相顆粒與溶液中的糖蛋白質(zhì)/肽作用，實(shí)現(xiàn)糖蛋白質(zhì)/肽的特異性富集。因此，固相基質(zhì)的類型也會(huì)對(duì)富集效果產(chǎn)生影響，Najam-Ul-Haq等[28]將纖維素、聚合物、金剛石作為基質(zhì)材料修飾酰肼基團(tuán)后，進(jìn)行酰肼化學(xué)富集，并對(duì)其富集效果進(jìn)行了評(píng)估，其中poly(GMA/DVB)基質(zhì)的回收率達(dá)到89%，優(yōu)于纖維素與金剛石(回收率分別為83%和71%)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基質(zhì)材料的親疏水性對(duì)于富集效果具有較大的影響。

此外，近年來(lái)發(fā)展了同樣基于醛基的胺化反應(yīng)[23]和肟點(diǎn)擊化學(xué)法[29]用于N-連接糖肽的富集。胺化反應(yīng)是利用固相載體中的氨基活性基團(tuán)與糖鏈中鄰二羥基氧化生成的醛基反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)糖蛋白或糖肽的選擇性富集。肟點(diǎn)擊化學(xué)法是利用羥胺與醛基能夠發(fā)生親核加成生成穩(wěn)定肟鍵，相比于酰肼反應(yīng)，羥胺由于α-效應(yīng)的親核能力更強(qiáng)，且反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定。這兩種方法與酰肼化學(xué)法類似，均不存在歧視效應(yīng)，結(jié)合材料的不同特點(diǎn)，可滿足不同類型樣品的需求，提高糖基化蛋白質(zhì)組的富集選擇性和特異性以及鑒定效率。

該類方法采用共價(jià)結(jié)合的方式，富集效率高且對(duì)糖鏈不存在歧視效應(yīng)。同時(shí)可通過(guò)同位素或親和試劑進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行糖蛋白質(zhì)組定量分析，因此，在高通量的N-型糖基化位點(diǎn)鑒定中得到了較好的應(yīng)用。然而，富集過(guò)程中采用了強(qiáng)氧化劑進(jìn)行氧化反應(yīng)，這些氧化過(guò)程往往伴隨復(fù)雜的副反應(yīng)，且會(huì)破壞糖鏈結(jié)構(gòu)，從而嚴(yán)重限制了該方法在糖型解析上的應(yīng)用。

1.3 親水作用色譜法

糖鏈中通常包含甘露糖、半乳糖、葡萄糖等單糖分子，這些單糖分子含有大量的羥基，因此糖基化肽段均具有較強(qiáng)的親水性，故親水作用色譜法(Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)也常用于糖肽的分離和富集[30]。該方法富集效果不受糖型的影響，不破壞糖鏈結(jié)構(gòu)，且具有操作簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)在線分析、與質(zhì)譜兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于糖蛋白質(zhì)組樣品分析中。親水作用色譜基于親疏水性對(duì)糖肽進(jìn)行富集，當(dāng)樣品中存在含較多親水性氨基酸的非糖肽或疏水性較強(qiáng)的糖肽時(shí)，該方法的特異性不高。對(duì)此，可通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相或加入離子對(duì)試劑來(lái)提高親水作用色譜的選擇性，Kolarich等[31]采用ZIC-HILIC材料，比較了乙腈、甲醇、乙醇和異丙醇4種不同流動(dòng)相對(duì)糖肽富集的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈對(duì)于親水或者疏水的糖肽均具有較好的保留能力，乙醇和異丙醇對(duì)于疏水性糖肽具有較好的富集效率。Kelly等[32]通過(guò)采用加入離子對(duì)試劑(50 mmol/L的NaCl)中和多肽上的電荷，擴(kuò)大了糖肽與非糖肽的親水性差距，從而提高了糖肽的富集選擇性。

近年來(lái)，各種適用于糖蛋白質(zhì)/糖肽富集和分離的新型固定相不斷涌現(xiàn)，早期有裸硅膠基質(zhì)固定相[33]，之后梁鑫淼等通過(guò)“點(diǎn)擊化學(xué)”的方法在硅膠基質(zhì)上修飾親水性功能單體，形成各種HILIC固定相，如點(diǎn)擊麥芽糖親水固定相[34]、點(diǎn)擊L-半胱氨酸親水固定相[35]、點(diǎn)擊谷胱甘肽親水固定相[36]等，Selman等[37]也通過(guò)“點(diǎn)擊化學(xué)”的方法制備了多聚糖硅膠基質(zhì)親水固定相，這些硅膠基質(zhì)修飾的固定相均實(shí)現(xiàn)了糖肽的高選擇性富集。除上述在硅膠基質(zhì)上修飾形成親水固定相外，Wang等[38]利用聚二乙氨基乙醇(DEAE)顆粒作為親水固定相進(jìn)行糖肽富集，利用該親水材料對(duì)血漿中糖蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，共鑒定出115個(gè)N-糖蛋白質(zhì)和219個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。張麗華等[39]發(fā)展了基于氫鍵輔助的親水作用富集材料并應(yīng)用于小鼠腦組織N-連接糖肽的富集，共鑒定1 997條N-糖基化肽段，對(duì)應(yīng)于686個(gè)N-連接糖蛋白，其中N-連接糖肽的富集選擇性高達(dá)94.6%。

由于金屬有機(jī)骨架(Metal-organic frameworks,MOFs )材料具有比表面積高、納米孔道有序、酸耐受能力高以及化學(xué)修飾性良好等特點(diǎn)，被越來(lái)越多地應(yīng)用于生物樣品的預(yù)富集中。Yang等[40]通過(guò)在磁性石墨烯(Magnetic graphene,MG)表面合成引入ZIF-8，形成MG與MOFs的復(fù)合物MG@Zn-MOFs，利用該材料對(duì)1 μL的人血漿中糖蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，共鑒定出151個(gè)唯一性糖蛋白質(zhì)和517個(gè)N-糖肽。除了直接使用MOFs顆粒作為功能基團(tuán)外，Bai等[41]以MOFs顆粒作為基質(zhì)材料制備了表面富含半胱氨酸的親水富集材料，該材料具有高比表面積和超強(qiáng)的親水性等優(yōu)勢(shì)。利用該材料對(duì)糖蛋白IgG的酶解產(chǎn)物進(jìn)行糖肽富集檢測(cè)，其最低檢測(cè)限達(dá)1 fmol/L。利用該材料對(duì)溶菌酶中糖蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，共鑒定出1 123個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于1 069個(gè)N-糖肽和614個(gè)N-糖蛋白質(zhì)。

HILIC 法具有富集條件溫和、操作簡(jiǎn)單、糖鏈結(jié)構(gòu)不被破壞、溶劑溫和以及易與質(zhì)譜聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于實(shí)際樣品中糖肽的富集。然而，該策略對(duì)于親水性物質(zhì)具有廣譜的富集效果，選擇性略低，并且由于糖蛋白質(zhì)與非糖蛋白質(zhì)在親水性上差異較小，限制了其在糖蛋白質(zhì)水平上的使用。

1.4 硼親和法

硼親和法也是常用的糖蛋白質(zhì)/糖肽富集策略。該方法原理是在堿性溶液中，硼酸分子中硼原子的雜化軌道由平面型的sp2雜化轉(zhuǎn)化為四面體型的sp3雜化，分子構(gòu)型從平面三角形轉(zhuǎn)化為四面體，此時(shí)，硼酸分子可與帶有1,2位或者1,3位順式二羥基結(jié)構(gòu)的糖鏈發(fā)生羥基化反應(yīng)生成環(huán)狀二酯；當(dāng)溶液環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝院螅h(huán)狀二酯水解釋放出結(jié)合的糖鏈和硼酸分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖基化蛋白質(zhì)/肽的富集[42-43]。

近年來(lái)，以硼酸及其衍生物作為親和配體的硼酸類親和材料得到了迅速發(fā)展和應(yīng)用。在早期的研究中，硼酸大多被作為流動(dòng)相來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白質(zhì)/肽的選擇性富集，而目前已轉(zhuǎn)變?yōu)橛米饔H和配體被修飾到磁性納米顆粒[44-45]、聚合物顆粒和硅膠顆粒[46-47]、整體材料[48]上。除上述基質(zhì)材料外，Li等[49]發(fā)展了以MOFs材料為基質(zhì)的硼親和材料：在Fe3O4表面生長(zhǎng)MOFs晶體ZIF-8，之后將硅烷化的硼酸功能單體修飾于Fe3O4/ZIF-8上，形成復(fù)合物Fe3O4/ZIF-8/APBA。由于具有較大的比表面積，該材料對(duì)于糖蛋白OVA的飽和吸附量達(dá)到833.33 mg/g。

與糖蛋白質(zhì)/糖肽的其它富集方法相比，硼親和法通過(guò)硼酸配基和糖鏈之間可逆的共價(jià)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白質(zhì)/糖肽的富集，能夠保持糖鏈的完整性，為后續(xù)糖鏈的解析提供了可能；另外通過(guò)簡(jiǎn)單的pH值調(diào)節(jié)，即可實(shí)現(xiàn)糖蛋白質(zhì)/糖肽的富集與洗脫，操作簡(jiǎn)單，且洗脫液多為酸性水溶液與質(zhì)譜條件兼容。但是，硼親和法中硼酸與不同糖型之間的相互作用力強(qiáng)弱不同，若目標(biāo)糖蛋白質(zhì)/肽中糖鏈為相互作用力較弱的糖型則富集能力較差。近期有報(bào)道[50]以苯硼酸的衍生物作為單體制備了含有硼酸功能基團(tuán)的聚合物，大大提高了與糖肽的結(jié)合能力和富集效率，在酵母細(xì)胞中鑒定到超過(guò)1 000個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，在鼠腦中鑒定到4 691個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，在人源細(xì)胞中鑒定到4 691個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。

1.5 其它富集策略

除以上方法外，還發(fā)展了其它的N-糖肽富集策略：①與非糖肽相比，糖肽的分子構(gòu)型一般大于非糖肽，Zhang等[51]采用SBA-15的介孔材料，利用其多孔性質(zhì)，將樣品中的非糖肽吸附于孔道，從而實(shí)現(xiàn)了糖肽與非糖肽的分離；②某些含有唾液酸的糖鏈在酸性條件下帶負(fù)電，可通過(guò)二氧化鈦富集唾液酸糖肽，之后再利用HILIC分離降低樣品的復(fù)雜度，將該策略用于Hela細(xì)胞中糖蛋白質(zhì)組分析，共鑒定出1 632條N-連接唾液酸糖肽，對(duì)應(yīng)于817個(gè)N-糖蛋白質(zhì)[52]。

2 展 望

目前，N-糖基化蛋白質(zhì)組富集技術(shù)得到了快速發(fā)展，為N-糖基化蛋白質(zhì)的規(guī)模化分析提供了技術(shù)支撐，極大地推動(dòng)了糖蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步。但目前大多數(shù)的N-糖基化蛋白質(zhì)和糖基化位點(diǎn)仍未得到解析，因此，新富集方法的開(kāi)發(fā)以及與質(zhì)譜技術(shù)的更好結(jié)合對(duì)于糖蛋白質(zhì)組學(xué)的研究及其生物學(xué)功能的解析仍然是十分必要的。另一方面，異常的糖基化修飾(包括特定糖蛋白質(zhì)量的變化和糖基化結(jié)構(gòu)的改變)與諸多病理過(guò)程密切相關(guān)，而且由于糖基化修飾的異質(zhì)性使其具有宏觀和微觀不均一性，因此，針對(duì)特定糖基化修飾或糖鏈結(jié)構(gòu)的專一性富集技術(shù)引起了研究者的極大興趣。隨著富集方法的不斷創(chuàng)新以及各類分析手段的發(fā)展，人類對(duì)糖基化修飾的認(rèn)識(shí)會(huì)更加深入，糖蛋白質(zhì)組學(xué)將會(huì)在疾病診斷、藥物靶點(diǎn)研究等方面發(fā)揮更大的作用。