張東升,嚴(yán)藝琳,熊曉輝,董曼佳,游京晶,張一平

(1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司,江蘇無(wú)錫 214063; 2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院,江蘇南京 211800)

嘔吐毒素,又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是一種由小麥赤霉病菌、禾谷鐮刀菌復(fù)合群產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物[1]。據(jù)報(bào)道,小麥赤霉毒素爆發(fā)頻率增加,DON成為小麥增產(chǎn)與質(zhì)量安全的主要威脅,尤其是我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域等重要冬麥區(qū)[2-3]。1998年,在國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評(píng)價(jià)報(bào)告中,DON被列為第3類致癌物,對(duì)人類及動(dòng)物的健康構(gòu)成了威脅[4]。歐盟要求供人食用的玉米、燕麥小麥中DON含量為低于1.75 mg/kg[5];國(guó)內(nèi)要求谷物及其制品的DON限量為1.0 mg/kg[6]。

目前,DON的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[7-8]、膠體金免疫層析法(GICA)[9-10]和高效液相色譜法(HPLC)[11-12]。其中ELISA法雖操作簡(jiǎn)單、靈敏度高,但不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),且假陽(yáng)性率高;GICA法雖然適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),但靈敏度低,但不能準(zhǔn)確定量。HPLC為國(guó)標(biāo)第二法,前處理需免疫親和柱凈化,成本高、時(shí)間長(zhǎng)。熒光定量免疫層析是以鑭系元素銪的螯合物納米微球?yàn)闊晒馓结?并結(jié)合醫(yī)學(xué)床邊檢驗(yàn)(POCT)的免疫層析技術(shù)[13-16],該法因簡(jiǎn)便、靈敏度高及準(zhǔn)確定量等特點(diǎn),而被廣泛應(yīng)用。

針對(duì)糧食收購(gòu)、儲(chǔ)運(yùn)及加工等環(huán)節(jié),急需快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)DON的方法。近年來(lái),高雷等[17]建立了高靈敏DON時(shí)間分辨熒光試劑盒的方法,雖靈敏度很高,但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),且需要昂貴的96孔時(shí)間分辨熒光儀;肖理文等[18]對(duì)DON時(shí)間分辨熒光層析卡的技術(shù)性能進(jìn)行了初探,但制備環(huán)節(jié)不詳。本文依據(jù)免疫競(jìng)爭(zhēng)抑制法構(gòu)建了DON時(shí)間分辨熒光免疫層析方法(TRFIA),重點(diǎn)探討層析卡制備中微球標(biāo)記的單抗?jié)舛燃癟RFIA應(yīng)用條件,環(huán)境溫度、層析時(shí)間、加樣體積及緩沖體系;同時(shí)評(píng)價(jià)該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度。以期建立適用于谷物及其制品中DON的快速定量方法,保障糧食、食品的質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、碳二亞胺(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA) 美國(guó)Sigma公司;DON-BSA偶聯(lián)物 本實(shí)驗(yàn)室制備并純化,DON與BSA偶聯(lián)比約10∶1,濃度5.8 mg/mL;抗DON單抗細(xì)胞株SW-3 F4 本實(shí)驗(yàn)室篩選并凍存,單抗亞型IgG1、間接ELISA IC50為90 ng/mL、親和常數(shù)3.1×108L/mol、抗DON單抗與DON、15-Ac-DON、3-Ac-DON及NIV的交叉反應(yīng)分別為100%、215%、<0.1%,純度95.4%,蛋白濃度4.3 mg/mL;羊抗鼠IgG 上海康成生物工程有限公司;銪納米微球 平均粒徑90 nm,表面活性基團(tuán)-COOH,激發(fā)365 nm、發(fā)射612 nm,Bangs Laboratories,Inc.;玻璃棉、硝酸纖維素膜(135s) 德國(guó)Merck Millipore;玉米、玉米面、小麥、面粉、面包、大麥 江蘇省糧食局糧油質(zhì)量監(jiān)測(cè)所;HP-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm) 美國(guó)賽芬科技公司;DON及其乙?；苌镉H和柱 江蘇省蘇微微生物研究有限公司。

SW-2時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀 江蘇省蘇微微生物研究有限公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HS-3垂直混勻儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;DZF-6030B真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HM3035三維劃膜噴金儀、CTS300數(shù)控裁條機(jī)、ZQ2000自動(dòng)斬切機(jī) 上海金標(biāo)生物科技有限公司;LC-20AT液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 時(shí)間分辨熒光免疫層析卡的制備[19]

1.2.1.1 抗DON單抗的熒光納米微球標(biāo)記 Mes溶液(0.05 mol/L,pH6.0):稱量2-(N-嗎啉)乙烷磺酸9.76 g、29.22 g NaCl、5 mL 10% 的十二烷基聚乙二醇醚，溶于1 L蒸餾水,并用3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH6.0;硼酸緩沖溶液(0.05 mol/L,pH8.0):A液:0.2 mol/L硼酸:1.237 g硼酸加100 mL水,B液:0.05 mol/L硼砂:1.907 g硼砂加100 mL水,以A∶B液體積比7∶3混合,再用水稀釋4倍。取待標(biāo)記單抗用硼酸緩沖溶液(0.05 mol/L,pH8.0)4 ℃透析過(guò)夜備用。取400 μL硼酸緩沖溶液于2 mL離心管中,加入100 μL熒光微球,漩渦振蕩,混勻,加入20 μL的EDC(10 mg/mL)Mes溶液(0.05 mol/L,pH6.0)。室溫振蕩活化15 min后,于10 ℃、10000 r/min離心10 min,棄上清,用0.5 mL硼酸緩沖液復(fù)溶。加入抗DON單抗,使終濃度為50～200 μg/mL。室溫下垂直混勻儀上反應(yīng)2 h。再加入1/10體積含10% BSA的硼酸緩沖溶液,于垂直混勻儀上繼續(xù)反應(yīng)2 h。離心洗滌2次,10 ℃、10000 r/min離心10 min,棄上清,用0.5 mL硼酸緩沖液復(fù)溶;最后一次洗滌離心后,用含1% BSA的硼酸緩沖液重懸,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 層析膜、結(jié)合墊及樣品墊的制備 a:層析膜:將硝酸纖維膜切成2.5 cm×30 cm的長(zhǎng)條,置三維劃膜噴金儀平臺(tái)上;用含5%甲醇的PBS(0.01 mol/L,pH7.2)將制備的DON-BSA抗原,稀釋至0.5～1.5 mg/mL,羊抗鼠IgG稀釋至1.0 mg/mL,分別放于存儲(chǔ)池A和B;以1 μL/cm分別將上述溶液噴點(diǎn)于檢測(cè)膜中央,形成檢測(cè)線和質(zhì)控線印跡,兩者相距0.5 cm;置37 ℃真空干燥箱60 min,將層析膜置塑料袋,4 ℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

b:結(jié)合墊:將玻璃棉切成1.5 cm×30 cm的長(zhǎng)條,置三維劃膜噴金儀平臺(tái)上;取0.5 mL納米微球標(biāo)記物,加入不同體積比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)含1% BSA、3% 蔗糖、0.6 mol/L NaCl、0.2% Tween-20和疊氮化鈉的硼酸緩沖溶液(0.05 mol/L,pH8.0)稀釋;利用噴頭以15 μL/cm,將上述溶液噴點(diǎn)于玻璃棉;置42 ℃真空干燥箱60 min,將玻璃棉置塑料袋,保存方法同1.2.1.2 a中所述。

c:樣品墊:將玻璃棉切成1.5 cm×30 cm的長(zhǎng)條,浸泡于含0.1 mol/L NaCl、0.2% Tween-20和0.1%疊氮化鈉的PB溶液(0.01 mol/L,pH7.2);保存方法同1.2.1.2a中所述。

1.2.1.3 熒光免疫層析卡的組裝 以PVC膠粘板作襯板,將層析膜粘貼在襯板的中央。將樣品墊、結(jié)合墊依次粘貼在層析膜的左端,將吸水墊粘貼在層析膜的右端,并且兩墊之間有1～2 mm的交聯(lián)。將組裝好的試劑板用自動(dòng)斬切機(jī)切割成長(zhǎng)60 mm、寬3 mm的板條,裝于塑料卡殼中。

1.2.2 測(cè)定條件的優(yōu)化

1.2.2.1 測(cè)定過(guò)程 將DON的標(biāo)準(zhǔn)品用50%甲醇定容,配制成1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;采用一定緩沖體系配,制成0、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。調(diào)節(jié)一定溫度,將層析卡及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別平衡至該溫度下,準(zhǔn)確移取一定體積標(biāo)準(zhǔn)工作液,加于層析卡的樣品孔中,使層析卡于相應(yīng)溫度下反應(yīng)一定時(shí)間,每個(gè)濃度做3次平行測(cè)試。由低濃度到高濃度進(jìn)行檢測(cè),時(shí)間分辨熒光儀檢測(cè)T線熒光強(qiáng)度與C線熒光強(qiáng)度,計(jì)算T/C值。以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度的自然對(duì)數(shù)值(lnC)為橫坐標(biāo),各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值與0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值的比值(以下采用B/B0表示,%)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 緩沖體系對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響 用PBS(0.01 mol/L,pH7.2)、PBS(0.05 mol/L,pH7.2)、含5% 甲醇的PBS(0.01 mol/L,pH7.2)分別配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,調(diào)節(jié)溫度至20 ℃,將層析卡及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液平衡至該溫度下,移取100 μL加于層析卡的樣品孔中,該溫度下反應(yīng)10 min。按1.2.2.1中所述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,比較斜率、截距及IC50。

1.2.2.3 環(huán)境溫度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響 以PBS(0.01 mol/L,pH7.2)為緩沖體系,調(diào)節(jié)溫度至10、20、30 ℃,將層析卡及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別平衡至該溫度下,移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液加于層析卡的樣品孔中,使層析卡于相應(yīng)溫度下反應(yīng)10 min。按1.2.2.1中所述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,比較斜率、截距及IC50。

1.2.2.4 加樣體積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響 以PBS(0.01 mol/L,pH7.2)為緩沖體系,調(diào)節(jié)溫度至20 ℃,將層析卡及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別平衡至該溫度下,分別移取50、100、200 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液加于層析卡的樣品孔中,使層析卡于相應(yīng)溫度下反應(yīng)10 min。按1.2.2.1中所述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,比較斜率、截距及IC50。

1.2.2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響 以PBS(0.01 mol/L,pH7.2)為緩沖體系,調(diào)節(jié)溫度至20 ℃,將層析卡及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別平衡至該溫度下,移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液加于層析卡的樣品孔中,使層析卡于相應(yīng)溫度下反應(yīng)10、15、20 min。按1.2.2.1中所述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,比較斜率、截距及IC50。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將DON的標(biāo)準(zhǔn)品用50%甲醇定容配制成1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;采用PBS(0.01 mol/L,pH7.2)稀釋成0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100 ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按1.2.2篩選的最佳條件進(jìn)行測(cè)定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并確定線性范圍。

1.2.4 樣品處理 準(zhǔn)確稱取5 g混合均勻的玉米等6種典型樣品(已粉碎),置于錐形瓶中,加入50 mL水,搖床劇烈振蕩30 min,用快速定性濾紙過(guò)濾。準(zhǔn)確移取50 μL濾液加入950 μL樣品稀釋液,混勻,按照1.2.2篩選的最佳測(cè)定條件進(jìn)行,最后將層析卡放入時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀中,即時(shí)測(cè)量。由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的劑量濃度,并乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)來(lái)定量。

1.2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.2.5.3 精密度 精密度是衡量試紙條的批內(nèi)差和批間差的重要指標(biāo),選擇低、中、高3種濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)品溶液,采用不同批次的測(cè)試卡,10次重復(fù)試驗(yàn),計(jì)算批間和批內(nèi)變異系數(shù)(CV)。

1.2.5.4 準(zhǔn)確性 a.加標(biāo)回收試驗(yàn):采用空白基質(zhì)樣品添加回收試驗(yàn),在小麥、玉米樣本中分別加入低、中、高濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀T/C值和標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測(cè)濃度。加標(biāo)回收率(%)=(實(shí)測(cè)濃度-空白濃度)/加標(biāo)濃度×100。

b.與IAC-HPLC法對(duì)比試驗(yàn):選取玉米、玉米面、小麥、面粉、面包、大麥等6種典型樣本24份,按1.2.4方法處理,同一份樣液分別采用DON熒光層析卡和IAC-HPLC[11]法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果對(duì)比分析,進(jìn)一步驗(yàn)證該方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.111第二法的一致性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010處理數(shù)據(jù)、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光微球標(biāo)記單抗

2.1.1 單抗標(biāo)記濃度及人工抗原劃膜質(zhì)量濃度的確定 固定二抗劃膜條件,考察了NC膜上3種不同包被DON-BSA抗原質(zhì)量濃度、與3種不同單抗?jié)舛?以標(biāo)記溶液的終濃度來(lái)表示)標(biāo)記的微球制成層析卡,以PBS(0.01 mol/L,pH7.2)為緩沖體系配制DON標(biāo)準(zhǔn)溶液。選擇本底熒光值較低、熒光值梯度好,且T線與C線比值在1.0～1.5之間的作為劃膜濃度及標(biāo)記抗體時(shí)的最佳稀釋濃度。結(jié)果表明(見(jiàn)表1),標(biāo)記溶液?jiǎn)慰菇K濃度100、200 μg/mL對(duì)于DON不同濃度的抑制率相當(dāng),但單抗用量小,確定劃膜濃度1.0 mg/mL,100 μL熒光微球標(biāo)記的單抗終濃度為100 μg/mL,即50 μg。

表1 劃膜質(zhì)量濃度與標(biāo)記單抗終濃度的確定Table 1 The determination of the concentration of the film and the final concentration of the marker

2.1.2 標(biāo)記單抗微球的稀釋倍數(shù)優(yōu)化 采用熒光微球標(biāo)記的單抗與不同緩沖溶液體積比混合,制成層析卡。結(jié)果見(jiàn)表2,選取T/C比在1.0～1.5,且各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值與0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值的比值為5%～75%。確定微球體積與緩沖液按照1∶4進(jìn)行混合噴于結(jié)合墊為佳。

表2 不同標(biāo)記單抗的微球稀釋倍數(shù)的確定Table 2 The determination of microspheres dilution multiple of different markers

2.2 測(cè)定條件的確定

2.2.1 緩沖體系對(duì)標(biāo)曲IC50的影響 從圖1、表3結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),5%的甲醇PBS(0.01 mol/L,pH7.2)和PBS(0.01 mol/L,pH7.2)對(duì)測(cè)定靈敏度、IC50、絕對(duì)系數(shù)、斜率幾乎完全一致,曲線完全重疊。含有一定有機(jī)溶劑的緩沖體系對(duì)于采用有機(jī)溶劑提取多毒素后,僅通過(guò)一定稀釋即可滿足測(cè)定的需求。而當(dāng)離子強(qiáng)度增加到0.05 mol/L時(shí),曲線的線性不易控制,且平行性差,所以選擇5%的甲醇PBS(0.01 mol/L,pH7.2)作為最佳緩沖體系。

圖1 不同緩沖體系對(duì)標(biāo)曲IC50的影響(n=3)Fig.1 The effect of different buffer systems on the standard curve IC50

2.2.2 環(huán)境溫度對(duì)標(biāo)曲IC50的影響 不同溫度下得到的直線如圖2、表3所示。濃度從0.5～25 ng/mL,僅20 ℃條件下曲線的決定系數(shù)R2>0.99,要達(dá)到R2>0.99,則10 ℃條件下線性范圍為0.5～10 ng/mL,30 ℃條件下線性范圍為1～25 ng/mL。隨溫度的升高,曲線的斜率變大,IC50變大,層析卡靈敏度降低至1.0 ng/mL,對(duì)于同一個(gè)樣品隨著溫度的升高,樣本的測(cè)定值偏低。從0.5 ng/mL濃度的抑制率來(lái)看,低溫下僅55%,雖靈敏度較高,但是從控溫的角度不太容易,考慮到現(xiàn)場(chǎng)以及一般實(shí)驗(yàn)室最容易達(dá)到的環(huán)境溫度,最佳選擇(25±2) ℃,且使用標(biāo)準(zhǔn)溶液在即時(shí)環(huán)境下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的溫度校正,以保證測(cè)定值的準(zhǔn)確性。而肖理文[15]報(bào)道的反應(yīng)溫度采用37 ℃恒溫反應(yīng),雖然是抗體、抗原最佳的反應(yīng)溫度,但是較高的溫度使得靈敏度降低,不利于檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā),其次控溫37 ℃不利于現(xiàn)場(chǎng)的操作。

圖2 不同反應(yīng)溫度對(duì)標(biāo)曲IC50的影響(n=3)Fig.2 The effect of different reaction temperatures on the standard curve IC50

2.2.3 加樣體積對(duì)標(biāo)曲IC50的影響 圖3、表3顯示,當(dāng)加樣體積為50 μL,高濃度的抑制率并不明顯,原因最大可能是隨著爬膜的進(jìn)行,液體體積變少,抗原抗體的反應(yīng)不完全,特別是C線處的熒光強(qiáng)度變?nèi)酢．?dāng)加樣體積增加至100、200 μL時(shí),結(jié)果顯示兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線基本相近,IC50差異小,100 μL加樣體積既能滿足抗原抗體充分反應(yīng)的溶液狀態(tài),且不溢出平行性好。而200 μL會(huì)因加樣體積過(guò)大溢出加樣孔,特別當(dāng)?shù)蜐舛葴y(cè)定時(shí),致使加樣濃度出現(xiàn)偏差,因此選擇100 μL作為最佳的進(jìn)樣體積。

圖3 不同加樣體積對(duì)標(biāo)曲IC50的影響(n=3)Fig.3 The effect of different adding volumes on the standard curve IC50

表3 不同測(cè)定條件下的曲線方程、絕對(duì)系數(shù)及標(biāo)曲IC50Table 3 The results of different measurement conditions on the equations，absolute coefficients and standard curve IC50

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)曲IC50的影響 免疫熒光微球隨著時(shí)間不斷涌動(dòng),儀器監(jiān)測(cè)到的T/C值是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,因此設(shè)置信號(hào)穩(wěn)定的時(shí)間為最佳的檢測(cè)時(shí)間[22]。在不同反應(yīng)時(shí)間下,所得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4、表3,反應(yīng)時(shí)間由10 min增加至20 min,同一標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的T/C基本穩(wěn)定,三條標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎完全重合,考慮到免疫層析快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn),將最佳檢測(cè)時(shí)間確定為10 min。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)曲IC50的影響(n=3)Fig.4 The effect of different reaction time on the standard curve IC50

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

由圖5可以發(fā)現(xiàn),橫坐標(biāo)采用的是濃度的自然對(duì)數(shù),通過(guò)繪制得到的依然是平滑的S曲線,這與免疫競(jìng)爭(zhēng)得到的曲線是一致的[20];同時(shí)在0.5～25 ng/mL濃度范圍內(nèi),有效劑量值即抑制率在76%～10%,線性回歸相關(guān)系數(shù)r=0.9992,直線方程y=-0.1723x+0.6442。由此,確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.5～25 ng/mL。

圖5 不同濃度(0.1～100 ng/mL)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=5)Fig.5 Standard curve of the different concentrations(0.1～100 ng/mL)(n=5)

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

Li等[23]研究顯示,在標(biāo)記相同抗體密度下,100 nm膠體金探針顯示與抗原結(jié)合的親和力最高,且在競(jìng)爭(zhēng)免疫層析試紙條中靈敏度最好。因此,研究采用的微球平均粒徑比肖理文等[18]采用的微球210 nm小了近1半,有助于提高標(biāo)記抗體與抗原的結(jié)合,提高靈敏度。但從層析卡制備的工藝上看,本研究建立的層析卡,規(guī)格是60 mm×3 mm,而肖理文等采用的90 mm×5 mm,即加樣孔的位置離檢測(cè)線越遠(yuǎn),層析膜越寬,則免疫標(biāo)記復(fù)合物通過(guò)檢測(cè)線的時(shí)間越滯后,反應(yīng)時(shí)間相對(duì)增加,有助于其靈敏度的提高[18]。因肖理文報(bào)道中,并未提及原料單抗的IC50值,在不考慮DON單抗IC50不一致的情況下,最終靈敏度與肖理文等報(bào)道的靈敏度相當(dāng),較熊齊榮等[9]、黃志兵等[10]建立GICA的靈敏度分別提高了400倍、200倍。

2.4.2 方法檢出限及定量限 對(duì)小麥、玉米空白基質(zhì)的測(cè)定結(jié)果如表4,根據(jù)1.2.5.2的公式計(jì)算,小麥與玉米的檢出限和定量基本一致。該方法小麥的檢出限為69.5 μg/kg,定量限為192.7 μg/kg,相比熊齊榮等[9]、黃志兵等[10]建立GICA的檢出限分別提高了7.2倍、14.4倍,與肖理文等[18]建立的層析卡檢出限和定量限(25、82 μg/kg)優(yōu)勢(shì)不明顯。究其原因主要在于樣品的稀釋倍數(shù)不同,本方法稀釋倍數(shù)為200,而肖理文等僅稀釋了55倍。較大的稀釋倍數(shù)優(yōu)勢(shì)在于,第一有利于降低樣品中干擾物質(zhì)的濃度;第二提取多毒素時(shí),常采用高濃度有機(jī)相,有利于降低有機(jī)溶劑的濃度,減小對(duì)免疫結(jié)合的干擾。

表4 小麥、玉米檢出限(LOD)及定量限(LOQ)Table 4 LOD and LOQ of TRFIA in wheat and maize

2.4.3 精密度 分別采用不同批次的熒光層析卡對(duì)低、中、高3種濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10次定量檢測(cè),批內(nèi)和批間CV值分別為3.82%～5.97% 和5.22%～10.15%(表5),批內(nèi)和批間CV均小于11%,說(shuō)明熒光層析卡均一性良好。

表5 熒光測(cè)試卡檢測(cè)DON的精密度試驗(yàn)(n=10)Table 5 Precision test of fluorescence immunochromatographic card to detect DON(n=10)

2.4.4 準(zhǔn)確性

2.4.4.1 加標(biāo)回收試驗(yàn) 根據(jù)檢出限和定量限,設(shè)定了4個(gè)濃度,涵蓋了檢出限、定量限和高濃度的加標(biāo)回收測(cè)定。分別對(duì)陰性小麥及玉米進(jìn)行不同水平的DON加標(biāo),加標(biāo)濃度分別為200、500、1000及2000 μg/kg,TRFIA重復(fù)測(cè)定5次,計(jì)算平均回收率在91.4%～109.3%(見(jiàn)表6)。

表6 小麥、玉米不同濃度加標(biāo)回收率(n=5)Table 6 The recovery at different concentrations in wheat and maize(n=5)

2.4.4.2 與IAC-HPLC法對(duì)比 將兩種方法對(duì)24份典型樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果如圖6。兩種方法的線性相關(guān)系數(shù)r=0.9754,結(jié)果高度相關(guān),具有良好的一致性。但從原料單抗與DON類似物的交叉,可以發(fā)現(xiàn),單抗與15-Ac-DON有215%的交叉,即樣品中含有15-Ac-DON則同樣被檢出,測(cè)定的結(jié)果應(yīng)是DON和15-Ac-DON的總量。而層析卡的結(jié)果與HPLC呈現(xiàn)出高度的一致性,更說(shuō)明了樣品中15-Ac-DON的含量很低,且HPLC測(cè)定中發(fā)現(xiàn)的 3-Ac-DON、NIV不影響TRFIA對(duì)DON的準(zhǔn)確定量。這與史建榮[2]調(diào)查結(jié)論基本一致,調(diào)查發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江流域的12個(gè)省份采集的231個(gè)F.asiaticum的菌株中,3-Ac-DON化學(xué)型占67%,NIV化學(xué)型占23%,15-Ac-DON化學(xué)型僅有10%。由此可見(jiàn),所建立的時(shí)間分辨熒光免疫分析法能滿足DON定量需求。

圖6 HPLC與TRFIA測(cè)定樣品中DON的相關(guān)性Fig.6 The correlation analysis of HPLC and TRFIA for determination of DON in different samples

3 結(jié)論

采用包裹有鑭系元素(Eu)螯合物的熒光納米微球作為單抗的標(biāo)記示蹤物,建立了DON時(shí)間分辨熒光免疫層析方法。每100 μL熒光微球結(jié)合純單抗50 μg,最佳劃膜濃度為1.0 mg/mL;靈敏度為0.25 ng/mL,檢出限69.5 μg/kg,測(cè)量范圍為100～5000 μg/kg,基本滿足了絕大多數(shù)谷物及其制品的檢測(cè)。采用IAC-HPLC法同時(shí)檢測(cè)小麥、面粉、玉米等24份樣品,并檢測(cè)到3-Ac-DON、NIV,但15-Ac-DON含量極低,所建立的TRFIA與其具有良好的一致性。

熒光免疫層析卡操作簡(jiǎn)單,谷物及其制品僅需簡(jiǎn)單提取并稀釋,室溫下10 min即可得出結(jié)果;配套小型時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀,適合基層單位現(xiàn)場(chǎng)大量樣本毒素指標(biāo)的定量,具有非常好的推廣應(yīng)用價(jià)值。DON層析卡在糧油中得到較好的應(yīng)用,但對(duì)于食品和飼料中的檢測(cè),還需確定其適用范圍和條件,對(duì)層析卡的貯存條件、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等還需進(jìn)一步研究,為商品化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。