田 晶,李巧玲

(河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050018)

梨是我國繼蘋果、柑橘之后的第三大水果,但由于我國梨的優(yōu)質(zhì)果率較低,且大多數(shù)品種貯藏性能有限,削弱了梨果的市場競爭力,因此除一部分鮮食外,大部分是將梨加工制汁,這樣既能滿足廣大消費者的需求又可以解決鮮梨的銷售問題[1]。有機酸是果汁中主要的風味營養(yǎng)物質(zhì),其含量高低與果汁制品的品質(zhì)有著密切關系[2]。天然果汁不僅營養(yǎng)豐富,而且果汁中的有機酸還可以改善人們的食欲,促進消化腺的活動,有助于食物的吸收。然而,由于水果原料和生產(chǎn)成本的限制,一些商家為了追求利潤,通常直接將甜味劑、香精、色素、防腐劑和酸味調(diào)節(jié)劑(主要為檸檬酸)等添加劑勾兌成果汁,或向少量原果汁中加入檸檬酸等食品添加劑勾兌成果汁,以次充好,以假亂真,因此果汁摻偽檢測成為國內(nèi)外關注的焦點[3-6]。

梨汁中存在的有機酸主要有:蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、莽草酸、富馬酸、奎寧酸、乳酸等,其中蘋果酸和檸檬酸為主要有機酸[7],而果汁摻偽中的重要成分即為蘋果酸和檸檬酸。由于梨果中的蘋果酸主要為L-蘋果酸,一般不含D-蘋果酸,即使有D-蘋果酸含量也非常小,因此,通過測定梨汁中L-蘋果酸和檸檬酸的含量及相互比例,可以鑒別梨汁的摻假現(xiàn)象[2]。在所有梨汁中蘋果酸的含量均大于檸檬酸的含量,即L-蘋果酸和檸檬酸含量之比大于1。如果檸檬酸含量超過一定比例或有D-蘋果酸存在,即可判定該梨汁中添加有外源性檸檬酸或DL型蘋果酸[2]。

有機酸含量的測定方法主要有:化學滴定法、液相色譜法[8-10]、熒光法、比色法、氣相色譜法、薄層色譜法等方法[11]?；瘜W滴定法一般只用于食品中總酸的測定;后面幾種方法雖然可以檢測單個有機酸的含量,但是需要對樣品進行預處理,存在耗時長、實驗數(shù)據(jù)處理繁瑣、檢測程序復雜等問題[11-12]。近紅外光譜分析技術(shù)不同于上述檢測手段,一般通過化學計量法抽取所需要的特征信息用于對目標成分的預測,不需要對樣品進行破壞、去除基體干擾等過程,因此,沒有有害物質(zhì)對周圍環(huán)境造成的污染。該方法具有檢測所需時間短、費用低、檢測程序簡單等優(yōu)點,是一種無損產(chǎn)品檢測的方法。

近年來,近紅外光譜技術(shù)在果汁飲料中的應用多集中于對蘋果汁品種、摻偽及果汁含量等方面的研究[13-21],在梨汁方面研究的較少,尤其在梨汁中具體成分的檢測方面研究更少。本研究擬結(jié)合參考文獻[22-26],探索用近紅外光譜來檢測梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸的含量,為梨汁品質(zhì)好壞的檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮皇冠梨 河北省石家莊市北國超市;L-蘋果酸、D-蘋果酸和檸檬酸標準品(純度≥99.0%) 河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院;甲醇(色譜純)、磷酸二氫鉀和磷酸(分析純) 天津康科德科技有限公司;0.45μm有機相微孔濾膜 天津市沃爾孚科技發(fā)展有限公司;實驗用水 均為超純水。

NIRSTMDA1650近紅外光譜儀(配有Mosic和WinISI II軟件,帶有樣品杯) 丹麥FOSS公司;LC-20A高效液相色譜儀(配有LC solution工作站和SPD-20A型紫外檢測器) 日本島津公司;AL204萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;TG18G高速離心機 鹽城市凱特儀器有限公司;PTD-20-3超純水制備儀 上海力新儀器有限公司;KUDOS-SK5200LHC超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司;PB-10型pH計 德國賽多利斯集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 梨原汁的制備 將購買的新鮮皇冠梨按以下工藝流程制成梨原汁[2],冷凍保存待分析測定。

原料→破碎→勻漿→離心→過濾→原汁→冷凍貯藏

操作步驟:將購買的新鮮皇冠梨清洗、去皮、去核,采用四分法取樣,可食用部分破碎混勻,再打成勻漿,并用超純水稀釋至原漿的五分之一,用8000 r/min的轉(zhuǎn)速對稀釋后的樣品進行離心,再用0.45 μm微孔濾膜過濾,將處理好的樣品放入冰箱中冷凍備用。

1.2.2 梨原汁中檸檬酸和蘋果酸的測定 梨原汁中檸檬酸和蘋果酸的測定按參考文獻[2]用高效液相色譜法檢測。色譜條件為:色譜柱BOSTON GREEN ODS-AQ C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);檢測波長210 nm;流動相,甲醇和磷酸二氫鉀(體積比為3∶97,pH2.9);流速,0.5 mL/min;柱溫,30 ℃。每個樣本平行測定三次,取平均值作為測定結(jié)果。

1.2.3 梨原汁光譜數(shù)據(jù)的采集 取1.2.1中制備的梨原汁大約2 mL小心倒入近紅外分析儀的樣品杯中,蓋上反射板。通過反復試驗,光譜采集過程中儀器工作參數(shù)為:光譜掃描范圍1100～1650 nm,分辨率0.2 nm,每份樣品重復采譜3 次,每次掃描樣品時要求重新裝樣,取平均反射吸光率光譜作為實驗數(shù)據(jù),試驗的環(huán)境溫度為25 ℃左右。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用WinISI II軟件對采集得到的近紅外光譜圖進行處理,并將一階導數(shù)、二階導數(shù)、多元散射校正(multiplication scatter correction,MSC)、變量標準化(standard normal variate,SNV)、去散射和SNV且去散射6種光譜預處理方法的效果進行比較。應用偏最小二乘(partial least square,PLS)法、修正的最小二乘(modified partial least square,MPLS)法和主成分回歸(principle component regression,PCR)3種數(shù)學校正方法分別建立數(shù)學模型。

用模型相關系數(shù)r、定標標準偏差(standard error of calibration,SEC)和交互驗證標準誤差(standard error of cross validation,SECV)作為模型精度評價指標,用預測相關系數(shù)(correlation coefficient of prediction,rp)、相對分析誤差(standard deviation ratio,SDR)和預測標準差(standard error of prediction,SEP)檢驗模型的準確度[27-29]。一般情況下,SECV和SEC值越小,r值越大,模型的精度越高。SEP和SDR值越小,rp值越大,表明模型的預測性能越好[30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法測定梨原汁中的檸檬酸和蘋果酸

盡管對于食品中有機酸的測定有相關的標準——GB 5009.157-2016《食品安全國家標準 食品中有機酸的測定》[31],但是由于蘋果酸是外消旋體,由L-蘋果酸和D-蘋果酸組成,國標GB 5009.157的測定方法只是對蘋果酸的測定,因此,本研究者通過對測定條件進行優(yōu)化,得到了檸檬酸、L-蘋果酸和D-蘋果酸的最優(yōu)色譜分離條件,該方法的回收率為91.7%～101.9%,相對標準偏差為0.12%～1.55%[2]。圖1為該條件下測定的檸檬酸和蘋果酸的標準品色譜圖,圖2為純梨汁色譜圖。由圖2可看出,純皇冠梨汁中檸檬酸含量較少,L-蘋果酸含量較多,沒有檢測到D-蘋果酸。

圖1 檸檬酸、L-蘋果酸和D-蘋果酸混合標準溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 40 μg/mL citric acid,L-malic acid and D-malic acid standard solution注：1.L-蘋果酸;2.檸檬酸;3.D-蘋果酸。

圖2 稀釋5倍后純梨汁的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of pure pear juice diluted 5 times注：1.L-蘋果酸;2.檸檬酸。

2.2 校正集和驗證集樣品的確立

取1.3.1中制備的梨原汁溶液70份。隨機選出50份作校正集樣品,余下20份組成獨立驗證集。表1為用高效液相色譜法測定的鮮皇冠梨原汁中L-蘋果酸和檸檬酸的測定結(jié)果。從該測定結(jié)果可得出,在梨原汁中檸檬酸的含量比L-蘋果酸低,這兩者的測定值均呈正態(tài)分布,說明所選樣品具有一定的代表性。

表1 校正集和驗證集鮮皇冠梨原汁中L-蘋果酸和檸檬酸含量統(tǒng)計Table 1 Statistics of citric acid and L-malic acid content in calibration set and validations set

2.3 梨原汁近紅外光譜圖的預處理

近紅外光譜采集時受儀器、環(huán)境條件、樣品背景等的影響,會出現(xiàn)基線漂移、光散射和噪聲等現(xiàn)象,這些現(xiàn)象會干擾光譜信息與樣本內(nèi)有效成分的分析,為了消除這些影響,突出有用信息,常用導數(shù)處理、MSC、SNV等預處理方法。導數(shù)處理可以消除基線漂移和其它背景的干擾,提高分辨率和靈敏度[31]。SNV和MSC可以有效地消除散射影響,增強與成分含量相關的光譜吸收信息[23]。

圖3A為新鮮的皇冠梨汁的近紅外光譜掃描圖。由圖中可知在1300～1500 nm范圍里包含著梨原汁的吸收信息,光譜圖在1450 nm達到最大吸光度,在此吸光度的點上不同個體的梨汁樣本存在著較大差異,這些差異是由于梨汁本身化學物質(zhì)含量的不同等造成的。由于原始光譜圖本身包含信息量過少,儀器或其它噪聲對光譜圖影響過大,需要對光譜進行預處理。

圖3 梨原汁近紅外光譜圖Fig.3 NIR spectra of pure pear juice注：A：原圖；B：一階導數(shù)處理后；C：二階導數(shù)處理后。

圖3B和圖3C分別為新鮮皇冠梨汁的一階導數(shù),二階導數(shù)近紅外光譜圖。導數(shù)計算處理時采用的光譜點間隔數(shù)和平滑處理間隔點均為4,沒做二次平滑處理。在一階導數(shù)光譜圖中的1360～1540 nm范圍內(nèi)包含的信息較為豐富,1400 nm處有明顯的波谷,1490 nm處有明顯的波峰。二階導數(shù)光譜圖給出的信息最為豐富,在1320～1550 nm的區(qū)間共存在三處波峰和波谷,該圖與原光譜圖和一階導數(shù)光譜圖有著顯著的差異性,由此可看出,對原光譜圖進行預處理是非常必要的。

2.4 預測模型的建立

為了建立最優(yōu)梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸含量的預測模型,本研究將不同的預處理方法與不同的統(tǒng)計數(shù)學校正方法相結(jié)合,并對結(jié)合后建立的數(shù)學模型進行分析。表2～表4分別為不同光譜預處理的鮮皇冠梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸的MPLS、PLS和PCR的模型對比。

表2 不同光譜預處理方法對鮮皇冠梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸的MPLS模型精確性的影響Table 2 Influence of different spectral pretreatment methods on the accuracy of MPLS model for citric acid and L-malic acid

表3 不同光譜預處理方法對鮮皇冠梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸的PLS模型精確性的影響Table 3 Influence of different spectral pretreatment methods on the accuracy of PLS model for citric acid and L-malic acid

表4 不同光譜預處理方法對鮮皇冠梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸的PCR模型精確性的影響Table 4 Influence of different spectral pretreatment methods on the accuracy of PCR model for citric acid and L-malic acid

由表2～表4可以看出,對采集到的皇冠梨汁運用不同光譜預處理方法處理后,運用MPLS所建立的數(shù)學模型中檸檬酸的r最高為0.8830,L-蘋果酸的r最高為0.9345;運用PLS所建立的數(shù)學模型中檸檬酸的r最高為0.9058,L-蘋果酸的r最高為0.9209;運用PCR所建立的數(shù)學模型中檸檬酸的r最高為0. 8602,L-蘋果酸的r最高為0.9195,由此可得出:對檸檬酸和L-蘋果酸而言,運用PCR這種數(shù)學校正方法建立的數(shù)學模型的精確度均比PLS和MPLS要差一些。在對檸檬酸所有的預處理方法中,MSC預處理法的相關系數(shù)最高,其值為0.9058;二階導數(shù)預處理法的定標標準差和交互驗證標準誤差最低,分別為0.0225和0.0288。但綜合來看,其最適宜模型處理方法為PLS結(jié)合MSC,該模型在未經(jīng)剔除異常點等優(yōu)化前,其最高r為0.9058,SEC和SECV分別為0.0301和0.0298,基本符合建立近紅外模型需要。在對L-蘋果酸的所有的預處理方法中,SNV去散射的預處理方法的相關系數(shù)最高,其值為0.9345;去散射預處理法的定標標準差和交互驗證標準誤差最低,分別為0.0924和0.0351。其最適宜模型處理方法為MPLS結(jié)合SNV去散射,該模型在未經(jīng)剔除異常點等優(yōu)化前,其最高相關系數(shù)為0.9345,SEC和SECV分別為0.2003和0.2856,適合建立近紅外模型。整體而言,L-蘋果酸的模型處理方法的精確度均優(yōu)于檸檬酸,這可能與檸檬酸在梨原汁中的含量較少,在用高效液相色譜法對其測定時相對標準偏差較大[2]等因素有關。

根據(jù)表2～表4中得到的最優(yōu)模型結(jié)果,進一步在剔除異常點后對L-蘋果酸和檸檬酸的最優(yōu)模型進行評價。圖4和圖5分別為鮮皇冠梨汁中L-蘋果酸和檸檬酸建模效果和優(yōu)化后的關系圖,從圖中可以看出,原梨汁中L-蘋果酸和檸檬酸測量值在剔除異常點后線性關系均明顯提高。

圖4 L-蘋果酸測量值與預測值之間的關系Fig.4 Linear relationship between measured value and prediction value of L-malic acid in MPLS model注：A：未剔除異常點；B：剔除異常點后。

圖5 檸檬酸測量值與預測值之間的關系Fig.5 Linear relationship between measured value and prediction value of citric acid in PLS model注：A：未剔除異常點；B：剔除異常點后。

L-蘋果酸經(jīng)過優(yōu)化后的最優(yōu)模型的相關系數(shù)可達0.9501,SEC為0.1803，SECV為0.1722。檸檬酸的最優(yōu)模型相關系數(shù)為0.9211，SEC為0.1043，SECV為0.1761?？梢钥闯鲂迈r皇冠梨汁中檸檬酸和蘋果酸的線性關系均較好,相關系數(shù)r均在0.9以上,可以用于實際樣品的預測。鮮皇冠梨汁L-蘋果酸和檸檬酸的最優(yōu)模型如表5所示。

表5 檸檬酸和L-蘋果酸的最優(yōu)模型Table 5 The optimal model of citric acid and L-malic acid

2.5 模型驗證

為了驗證所建近紅外定標模型的精確度和準確度,利用所建模型對驗證集20個鮮皇冠梨汁樣本進行預測,結(jié)果如表6所示。由表6可以看出，利用所建模型對鮮皇冠梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸的預測效果較好,檸檬酸和L-蘋果酸的預測相關系數(shù)rp都在0.95以上,其中,L-蘋果酸的rp高達0.985,說明化學分析值和近紅外分析值之間具有很好的相關性,SEP最低為0.039%,SDR最大為3.46,定標效果良好,所建定量模型有良好的預測性能。

表6 鮮皇冠梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸含量定標模型的預測結(jié)果Table 6 The prediction model results of citric acid and L-malic acid content in Huangguan pear juice

3 結(jié)論

利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合統(tǒng)計數(shù)學處理方法構(gòu)建了梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸的預測模型。采用SNV、MSC、一階導數(shù)和二階導數(shù)等6種光譜的預處理方法來消除圖譜中基線漂移、光散射和噪聲等對光譜信息的影響。將不同預處理的方法同PCR法、MPLS和PLS法三種統(tǒng)計數(shù)學處理方法相結(jié)合分別建立檸檬酸和L-蘋果酸的數(shù)學模型。通過對比發(fā)現(xiàn),檸檬酸的最適宜模型處理方法為PLS結(jié)合MSC,該模型在剔除異常點優(yōu)化后,其最高相關系數(shù)為0.9211;L-蘋果酸的最適宜模型處理方法為MPLS結(jié)合SNV且去散射,該模型在剔除異常點優(yōu)化后,其最高相關系數(shù)為0.9501。優(yōu)化后的最佳預測模型預測相關系數(shù)最高可達0.985,預測標準差最低為0.039%,相對分析誤差最大為3.46。利用此模型可以較為精確地進行梨汁中檸檬酸和L-蘋果酸的快速無損檢測。本研究為梨汁摻偽快速無損檢測提供了參考。