劉 蓓,高 超,邱 悅,沈明浩,*

(1.長春科技學(xué)院,吉林長春 130660; 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118)

款冬,別名冬花、蜂斗菜,是菊科款冬屬多年生草本植物[1],全屬僅一種。我國傳統(tǒng)上使用款冬花入藥,葉柄多當(dāng)做蔬菜食用,據(jù)《本草》記載,款冬潤肺、瀉熱、止嗽,為治嗽要藥[2]。目前關(guān)于款冬的研究主要集中在款冬花的化學(xué)成分及藥理活性這兩方面,已有研究對款冬花中的黃酮類、有機酸、萜類、生物堿、揮發(fā)油、多糖等活化學(xué)成分進行了提取、分離及鑒定,其黃酮類物質(zhì)含量高達9.7%[3-6];在藥理活性方面,Yun T等[7]研究報道了款冬花揮發(fā)油能改善肺纖維化大鼠肺功能及細胞外基質(zhì)代謝。羅強[8]等研究表明款冬花多糖可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,其抗腫瘤效應(yīng)可能與細胞凋亡相關(guān)基因表達的調(diào)控有關(guān)。更有關(guān)于抗炎、抗結(jié)核以及神經(jīng)保護方面的報道[9]。

然而關(guān)于款冬植物本身的研究報道較少,Chanajkaczmarek J等[10]從款冬葉中提取分離并鑒定了六種黃酮醇,三種槲皮素衍生物,并且檢測到三種酚酸物質(zhì)。Adamczak A等[11]使用HPLC-DAD方法檢測款冬葉中生物堿含量。黃酮類物質(zhì)是款冬植物中一類重要的活性物質(zhì),黃酮類化合物是母核結(jié)構(gòu)為2-苯基色原酮的多酚類化合物[12],多以糖苷形式存在于物質(zhì)中,是一類二級代謝產(chǎn)物,廣泛分布在各種植物中,是植物中的一種有效的活性物質(zhì)。目前報道黃酮類物質(zhì)在降血脂[13]、防治心腦血管疾病[14]、抗氧化[15]、抑菌抗病毒[16]等方面具有良好的作用效果。關(guān)于款冬中黃酮類物質(zhì)的提取及生理功能作用無相關(guān)報道,因此本文首次對款冬總黃酮進行提取,優(yōu)化提取條件,并利用SP-825大孔吸附樹脂進行純化,對純化處理的總黃酮進行降脂及抗氧化作用研究,以期為款冬植物的開發(fā)利用提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色植物款冬 吉林省臨江市，晾干,粉碎,過40目篩,石油醚脫脂(液料比mL/g為5∶1),晾干備用;昆明種小白鼠(SCXK-(吉)2003-0001),吉林大學(xué)試驗動物中心提供;益生牌試驗動物飼料(1095) 長春市憶斯試驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司;小鼠高脂飼料[17]:基礎(chǔ)飼料79.5%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽鹽0.5%,試驗室自制;亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、石油醚、無水乙醇、正丁醇、甲醇,以上試劑均為分析純,北京化工;SP-825大孔吸附樹脂,東鴻化工有限公司;羧甲基纖維素鈉(食品級)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品均來自于上海析明生物科技有限公司;總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒,均購買于南京建成生物工程研究所。

AUY-220電子天平 島津國際貿(mào)易有限公司;TY92-II型超微粉碎機 寧波新芝生物科技公司;KQ-250B型超聲波清洗器 東京理化器械株式會社;層析柱 上海辰喬生物科技有限公司;恒流泵 廣州滬瑞明儀器公司;RE52-ASDFGHJ98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器公司;SP-722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;DK-S28型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏試驗設(shè)備公司;WD-2102型自動酶標(biāo)儀 北京市六一儀器廠;GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;水流抽氣機A-1000S 日本EYELA;DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司;超純水系統(tǒng) 法國Millipore公司;U410超低溫冰柜 美國NBS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 款冬總黃酮的提取 精確稱量款冬粉末1.0 g,加入一定量適宜濃度的乙醇溶液,在一定溫度下,超聲一段時間,抽濾得濾液,減壓回收乙醇至濾液剩2 mL左右為止,正丁醇水飽和溶液萃取2次,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL,70%乙醇定容100 mL,加入1 g活性炭進行脫色處理,過濾后,醇沉除雜,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至25 mL得樣品液,待測。將樣品液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷凍干燥處理后得款冬葉總黃酮粗提物。

1.2.2 款冬總黃酮得率的測定 配制濃度為0.10 mg/mL(溶劑是濃度為70%的乙醇溶液)的蘆丁對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液,待用。參照張國建等[18]方法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線,制定得到吸光度A-濃度C(mg/mL)的關(guān)系方程式為:A=0.0065C+0.0243,R2=0.9993。根據(jù)繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算出款冬總黃酮的含量。按以下公式計算總黃酮得率:

總黃酮得率(%)=提取總黃酮質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100

1.2.3 單因素實驗設(shè)計 單因素條件設(shè)定:乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%);料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g∶mL);提取溫度(40、50、60、70、80 ℃);提取時間(10、20、30、40、50 min)。分析單因素對得率值影響。固定單因素值為乙醇體積70%、料液比1∶40 (g∶mL)、提取溫度50 ℃、提取時間30 min。

1.2.4 Box-Behnken設(shè)計 通過單因素實驗選出對款冬葉黃酮得率值影響較大的三個因素,利用響應(yīng)面設(shè)計試驗共17組。Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Experimental design factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 款冬中總黃酮的純化 按照1.2.4的最佳提取條件提取出款冬總黃酮,采用丁彩麗等[19]方法進行純化處理。純化條件為:選擇SP825大孔吸附樹脂,pH為3～4,以2 BV/h的流速進行吸附,最大上樣量為44倍樹脂體積,3 BV的70%乙醇溶液以1～2 BV/h流速進行洗脫。將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷凍干燥后得純化后款冬總黃酮粉末。按以下公式計算總黃酮純度:

總黃酮純度(%)=純化黃酮質(zhì)量/黃酮粗提物質(zhì)量×100

1.2.6 高脂模型動物分組及造模 選取健康的昆明種小白鼠,適應(yīng)環(huán)境7 d后隨機分組,每組10只(雌雄各5只),共5組(空白對照組,模型對照組,黃酮高、中、低劑量組)。試驗階段空白組連續(xù)給予基礎(chǔ)飼料,其他組連續(xù)飼喂自制的高脂飼料,飼喂高脂飼料4周左右即可建模成功。降脂試驗期間各試驗組給予總黃酮低、中、高劑量組(100、200、400 mg/kg),溶解各功效成分的灌胃溶劑為0.5%的羧甲基纖維素鈉(食品級)。模型對照組和正常對照組灌胃溶液為0.5%的羧甲基纖維素鈉。各試驗組的灌胃劑量均為10 mL/kg,灌胃1 次/d,連續(xù)21 d。

1.2.7 降血脂指標(biāo)的測定 試驗周期結(jié)束后,各高脂飼料組小鼠禁食24 h,基礎(chǔ)飼料組小鼠禁食12 h,摘眼球取血,將血液放在于4 ℃條件下以3500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min得血清(上清液)。按照試劑盒說明書測定血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量。

1.2.8 抗氧化的指標(biāo)測定 試驗周期結(jié)束后,高脂飼料組小鼠禁食24 h,基礎(chǔ)飼料組小鼠禁食12 h,頸椎脫臼后立即取出肝臟,生理鹽水漂洗肝臟表面血液,濾紙吸干生理鹽水,以免影響組織液的濃度配比。取處理過的肝塊組織,稱重,按1∶9的比例添加生理鹽水,使用玻璃勻漿機制備得10%的肝組織勻漿液。同理可制1%、0.25%的肝組織勻漿液,該試驗操作條件為4 ℃。按照試劑盒說明書測定總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽(GSH)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響 由圖1知,觀察折線圖的變化,發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達到70% 時,款冬總黃酮的得率值最大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)再增加是折線走勢出現(xiàn)明顯的下降趨勢。黃酮類物質(zhì)易溶于有機溶劑,少數(shù)溶于水。出現(xiàn)上述的原因可能是乙醇體積加大,溶于有機溶劑部分的黃酮類物質(zhì)達到飽和,而溶于水的部分的黃酮類物質(zhì)不能充分溶于溶劑中。因此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%～80% 作為優(yōu)化范圍。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對得率影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on yield

2.1.2 料液比對總黃酮得率的影響 由圖2知,觀察折線圖走勢發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比達到1∶40 (g∶mL)時,款冬總黃酮得率出現(xiàn)最大值。料液比小于1∶40 (g∶mL)時,折線圖的走勢是逐漸上升的,當(dāng)大于1∶40 (g∶mL)時得率值出現(xiàn)下降。分析原因可能是加大料液比可以使原料充分與溶劑混合,有利于總黃酮的溶出,一旦達到飽和后會使得率降低。故選擇料液比為1∶30～1∶50 (g∶mL)作為優(yōu)化試驗的范圍。

圖2 料液比對得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield

2.1.3 提取溫度對總黃酮得率的影響 由圖3可知,觀察折線圖可知當(dāng)提取溫度達到50 ℃時,款冬總黃酮得率值達到最大,之后隨著溫度升高,得率逐漸變小。出現(xiàn)此實驗結(jié)果可能是乙醇揮發(fā)點較低,溫度越高揮發(fā)越快,會致乙醇的濃度降低,進而影響總黃酮的得率。因此,可將提取溫度在40～60 ℃作為優(yōu)化試驗的范圍。

圖3 提取溫度對得率的影響Fig.3 Effect of extract temperature on yield

2.1.4 提取時間對總黃酮得率的影響 由圖4可知,觀察提取時間與款冬總黃酮得率值的折線走勢發(fā)現(xiàn),當(dāng)提取時間達到30 min時,得率值達到最大,當(dāng)提取時間大于30 min以后,得率值增加幅度不大。綜合考慮確定時間為30 min不再進行優(yōu)化。

圖4 提取時間對得率的影響Fig.4 Effect of extract time on yield

2.2 款冬總黃酮響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果 Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)值見表2。

表3 Box-Behnken試驗方差分析Table 3 ANOVA of Box-Behnken

圖5 乙醇體積與超聲溫度的交互作用圖Fig.5 Interaction of volume of ethanol and extract temperature hydrolysis

圖6 料液比與超聲溫度的交互作用圖Fig.6 Interaction of ratio of solid to liquid and extract temperature

2.2.3 驗證試驗 響應(yīng)面法得到款冬總黃酮提取最佳工藝為在提取時間30 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,料液比41∶1 (mL∶g),超聲溫度58 ℃。按此工藝重復(fù)三次平行實驗,款冬總黃酮得率為7.18%,與響應(yīng)面擬合理論值相等,因此實驗結(jié)果可靠,提取工藝穩(wěn)定可行。

2.3 款冬總黃酮純化結(jié)果

按照最優(yōu)條件提取款冬總黃酮,測定款冬總黃酮的純度為29.8%。將該條件下提取的款冬總黃酮進行純化處理,純化條件參照1.2.5。純化后款冬中總黃酮的純度為63.2%,與純化處理前相比款冬總黃酮的純度升高了2.12倍,大大提高了款冬總黃酮的含量。說明SP-825大孔吸附樹脂具有較強的吸附作用,可以進一步起到分離純化效果,提高純化物純度。

2.4 款冬總黃酮對降血脂作用的影響

近年來世界上高血脂癥人群增加,高血脂癥已成為危害人類的健康疾病之一[20]。高血脂癥是指血液內(nèi)膽固醇和甘油三酯及相關(guān)脂蛋白的升高(也包括高密度脂蛋白的降低),目前報道中藥和相關(guān)制劑對于高血脂癥具有治療保健預(yù)防的功能[21]。天然植物存在功效成分如黃酮、皂苷、多糖等，在降脂方面表現(xiàn)出良好的作用效果。

2.4.1 款冬總黃酮對小鼠血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的影響 由表4可知,模型組的TG、TC含量都高于空白對照組且組間組間差異性極顯著(p<0.01),說明高血脂模型小鼠建模成功。與模型組相比,款冬總黃酮高、中、劑量組的TG含量均差異性顯著(p<0.05)或極顯著(p<0.01),說明款冬總黃酮可以有效調(diào)節(jié)TG水平;與模型對照組相比,款冬總黃酮各劑量組的TC水平均差異性極顯著(p<0.01),說明各劑量組在TC水平上作用效果明顯。說明款冬總黃酮各劑量組可以有效調(diào)節(jié)模型小鼠的TC和TG水平,降脂作用效果顯著,且降脂效果劑量呈正相關(guān)。

表4 款冬總黃酮對小鼠血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的影響Table 4 Effect of Tussilago farfara L. total flavonoids on the contents of TG、TC in serum of

2.4.2 款冬總黃酮對小鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的影響 由表5可知,與空白對照組相比,模型對照組的HDL-C和LDL-C均差異性極顯著(p<0.01),說明模型可用。在HDL-C水平上,同模型組相比款冬葉總黃酮各劑量均差異性極顯著(p<0.01)，可以有效調(diào)節(jié) HDL-C這一指標(biāo)。在LDL-C水平上,款冬總黃酮各劑量組均不同程度低于模型對照組且組間差異性顯著(p<0.05)或極顯著(p<0.01),可以有效降低模型小鼠LDL-C含量。說明款冬總黃酮各劑量組可以有效調(diào)節(jié)模型小鼠的LDL-C和HDL-C水平,降脂作用效果顯著,且降脂效果與劑量呈正相關(guān)。

表5 款冬總黃酮對小鼠血清中HDL-C和LDL-C的影響Table 5 Effect of Tussilago farfara L. total flavonoids on the contents of HDL-C、LDL-C in serum of

2.5 款冬總黃酮對抗氧化作用的影響

機體中的超氧化物歧化酶SOD是清除機體中氧自由基的一類重要酶;MDA是由超氧自由基攻擊多價不飽和脂肪酸而生成的脂質(zhì)氧化物,代表機體的損傷程度;谷胱甘肽(GSH)可將機體內(nèi)有害物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)并排泄出體外[22-24]。因此,將T-SOD、MDA及GSH的含量作為抗氧化的指標(biāo)。由表6可知,同空白對照組相比,模型組小鼠肝組織中的 T-SOD和GSH含量降低,MDA含量顯著升高,且組間差異性極顯著(p<0.01),說明模型小鼠可用。與模型組相比,款冬總黃酮高、中、低劑量組均可顯著增加模型小鼠血清中T-SOD和GSH含量,降低MDA含量,差異性上均為極顯著(p<0.01)。說明款冬總黃酮具有一定抗氧化作用。綜合各組數(shù)據(jù)分析最佳劑量組為款冬總黃酮高劑量組。

表6 款冬總黃酮對小鼠肝組織總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的影響Table 6 Effect of coltsfoot total flavonoids on the contents of T-SOD、MDA、GSH in liver tissue of

3 結(jié)論

對款冬中有效成分黃酮采用超聲波輔助提取法優(yōu)化的試驗中,以得率值作為評定指標(biāo),提取時間30 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,料液比1∶41 (g∶mL),超聲溫度58 ℃,在相同件下做三次驗證試驗得得率平均值為7.18%,試驗?zāi)Ｐ涂捎?提取工藝穩(wěn)定可行。經(jīng)SP-825大孔吸附樹脂純化提高了款冬總黃酮純度,為63.2%。

降脂試驗以高脂飼料誘導(dǎo)構(gòu)高脂模型小鼠,測定試驗組的指標(biāo)(TC、TG、LDL-C、HDL-C),結(jié)果說明款冬總黃酮各劑量組指標(biāo)與模型組相比均差異性顯著。降脂作用效果與劑量呈正相關(guān),款冬總黃酮具有良好的降脂效果。

抗氧化試驗,款冬總黃酮高、中、低劑量組均可升高SOD和GSH的含量,并能降低有害物質(zhì)MDA的含量,說明款冬總黃酮具有一定抗氧化作用。綜合各組數(shù)據(jù)分析最佳劑量組為款冬總黃酮高劑量組。