楊勝遠(yuǎn),郭文怡,李紫君,蘇巧云,黃慧玲,曾 嬋,彭羅慧

(嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,廣東湛江 524048)

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC4.1.1.15)是一種胞內(nèi)酶,廣泛存在于生物細(xì)胞中,能催化L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)的α-羧基發(fā)生脫羧反應(yīng)而生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)[1],專一性極強(qiáng),已被用于新資源食品GABA的生物合成和手性物質(zhì)DL-谷氨酸(DL-glutamic acid,DL-Glu)的拆分,尤其是微生物源GAD的工業(yè)化應(yīng)用備受關(guān)注[1-3]。由于GAD的作用底物和產(chǎn)物都是小分子,能透過細(xì)胞膜,因此為了克服微生物細(xì)胞破碎難題,降低生產(chǎn)成本,微生物全細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化法深受GABA或D-Glu生產(chǎn)領(lǐng)域的青睞[4-9]。然而,由于微生物GAD活力普遍偏低,致使GABA和D-Glu的生物合成成本居高不下,因此如何提高GAD催化活性是GAD工業(yè)應(yīng)用亟需解決的關(guān)鍵問題。

對GAD激活劑的研究已有一些報(bào)道,但由于不同來源的GAD的結(jié)構(gòu)存在差異,GAD激活劑存在較大差異,例如時粲等[10]發(fā)現(xiàn)Fe2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、異戊醇和吐溫20對大腸桿菌表達(dá)的植物乳桿菌GAD活力具有一定促進(jìn)作用,陳琳等[11]發(fā)現(xiàn)Ca2+、Cu2+、Ni2+對大腸桿菌表達(dá)的嗜熱鏈球菌GAD活力具有一定促進(jìn)作用,然而Yang等[12]研究表明Cu2+對唾液鏈球菌嗜熱亞種GAD具有抑制作用,但Ba2+對GAD具有促進(jìn)作用。金屬離子作為激活劑,對GAD活性的促進(jìn)能力有限,有的金屬離子存在一定毒性,并會在轉(zhuǎn)化體系中引入大量的鹽,對下游提取工藝和產(chǎn)品的安全性均不利。在全細(xì)胞GAD的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中,也有文獻(xiàn)采用表面活性劑(如Triton X-100)[11]或有機(jī)溶劑(如二甲苯)[13]對細(xì)胞進(jìn)行透性化處理,破壞細(xì)胞膜的完整性,增加細(xì)胞內(nèi)外對底物和產(chǎn)物的交換能力,對全細(xì)胞GAD的表觀活力也有很好的促進(jìn)作用,但用于透性化處理的有機(jī)試劑的安全性難以保證,工業(yè)透性化處理細(xì)胞的程度難以控制,工藝復(fù)雜。732陽離子交換樹脂因使用方便、分離效果好、安全性高、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn),在綠色化學(xué)領(lǐng)域已被廣泛用于物質(zhì)的分離純化。作者前期研究表明,732陽離子交換樹脂對屎腸球菌全細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性有顯著的促進(jìn)作用,對此尚鮮見報(bào)道,732陽離子交換樹脂對全細(xì)胞GAD活性的促進(jìn)機(jī)制還不清楚,亟待研究。

本文主要從732陽離子交換樹脂對細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的pH、底物效應(yīng)和產(chǎn)物效應(yīng)的角度對732陽離子交換樹脂促進(jìn)細(xì)胞GAD活力的作用機(jī)制進(jìn)行探討,以期為732陽離子交換樹脂作為GAD促進(jìn)劑在酶工程中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

屎腸球菌(Enterococcusfaecium)GDMCC60203 作為專利菌種保藏于廣東省微生物菌種保藏中心,為嶺南師范學(xué)院綠色生物制造研究室從泡菜中分離獲得,原菌株保藏號為LNSF2;屎腸球菌GAD純酶 (7489.18 U/mg)為嶺南師范學(xué)院綠色生物制造研究室采用親和層析自行純化獲得,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗(yàn)呈現(xiàn)單一條帶,達(dá)到了電泳純;γ-氨基丁酸(含量≥99%)和異硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate,PITC) 美國Sigma-Aldrich公司;乙腈、乙酸和三乙胺 色譜純,美國TEDIA公司產(chǎn)品;其余試劑 均為國產(chǎn)市售分析純試劑和生化試劑;732陽離子交換樹脂 廊坊沃恒化工有限公司;改良PSB(Peptone-Sucrose-Beef extract)培養(yǎng)基 參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行配制。

Agilent 1200 Series型高效液相色譜儀(配制G1354A四元梯度泵、G1316A 柱溫箱、G1314B可變波長紫外檢測器、Chemstation工作站等) 美國安捷倫公司;PSH-200型生化培養(yǎng)箱 中科生命科技股份有限公司;Centrifuge 5804R型冷凍離心機(jī) Eppendorf公司;VX-200型漩渦混合儀 美國Labnet公司;AUW120型電子分析天平 日本Shimadzu公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1E.faeciumGDMCC60203菌懸液制備 從4 ℃保藏的E.faeciumGDMCC60203斜面挑取1環(huán)菌苔接入改良PSB培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,再按體積比為1∶100的接種量轉(zhuǎn)接入改良PSB培養(yǎng)基,于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h作為種子液,然后將種子液按體積比為1︰50的接種量接入改良PSB培養(yǎng)基,于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h,作為發(fā)酵醪。將發(fā)酵醪在4 ℃于8500 r/min離心20 min,收集菌體。分別在含菌體的離心管中加入50 mL 0.85 g/L NaCl溶液,攪散菌體進(jìn)行重懸洗滌,然后在4 ℃于8500 r/min離心15 min,收集菌體。每克濕菌體加入10 mL pH4.2、0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液,均質(zhì)分散均勻,制成100 mg/mL菌懸液。

1.2.2 732陽離子交換樹脂的再生和平衡 再生:用約2倍樹脂體積的1 mol/L NaOH溶液浸泡20～30 min,以蒸餾水洗至中性,然后用約2倍樹脂體積的1 mol/L HCl溶液浸泡20～30 min,再用蒸餾水洗至中性,備用。

乙酸鹽緩沖液平衡樹脂:稱取20 g 樹脂加入pH4.2、0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液40 mL,室溫間歇攪拌浸泡30 min,尼龍濾布過濾,再以相同pH的乙酸鹽緩沖液重復(fù)平衡至濾液pH基本接近于4.2。

L-Glu溶液平衡樹脂:分別稱取樹脂20 g與pH分別為4.2、4.6、5.0、5.4的0.3 mol/LL-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)40 mL混合,室溫間歇攪拌浸泡30 min,尼龍濾布過濾取樹脂,重復(fù)平衡直至濾液pH與原L-Glu溶液的pH基本一致。

1.2.3 HPLC測定GABA和L-Glu含量的方法 參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品液注入1.5 mL的錐形離心管,加入50 μL 乙腈-水-三乙胺-PITC(體積比7∶1∶1∶1),混勻,室溫下放置1 h 后,加入150 μL 流動相A-流動相B(體積比80∶20),漩渦混合器振蕩1 min,然后加入600 μL正己烷,漩渦混合器振蕩1 min,靜置10 min。用注射器吸取下層溶液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾備測。HPLC色譜條件為:ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;檢測波長254 nm;進(jìn)樣量20 μL,柱溫25 ℃;采用流動相A與流動相B體積比80∶20,以0.6 mL/min線性等梯度洗脫。流動相A:pH5.8、0.1 mol/L乙酸鹽緩沖液,每升緩沖液中分別含三乙胺0.5 mL、乙酸0.7 mL和乙腈 5.0 mL。流動相B:60%乙腈溶液。

1.2.4 732陽離子交換樹脂交換物的洗脫方法 采用0.15 mol/L Na2CO3溶液進(jìn)行洗脫。將樹脂浸泡在20 mL Na2CO3溶液中,室溫振蕩洗脫5 min,濾布過濾,取洗脫液,重復(fù)洗脫2次,合并洗脫液。將洗脫液于4 ℃,8500 r/min離心5 min,取上清液備測。

1.2.5 GAD純酶和全細(xì)胞GAD活性的測定 GAD純酶活性的測定:將L-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)1.5 mL與GAD純酶0.5 mL混合,40 ℃水浴反應(yīng)30 min,立即加入-20 ℃冷凍的無水乙醇2 mL,混勻,于4 ℃、8500 r/min離心15 min,取上清液采用HPLC測定GABA含量;以121 ℃滅活10 min的GAD純酶代替實(shí)驗(yàn)組GAD純酶按同樣操作作為空白對照。全細(xì)胞GAD活性的測定:將L-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)1 mL與菌懸液1 mL混合,于40 ℃水浴反應(yīng)6 h,立即加入-20 ℃冷凍的無水乙醇2 mL,于 4 ℃、8500 r/min離心15 min,取上清液采用HPLC測定GABA含量;以121 ℃滅菌20 min的菌懸液代替實(shí)驗(yàn)組菌懸液進(jìn)行同樣操作作為空白對照。GAD純酶或全細(xì)胞GAD酶活力定義:在測定條件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量為1個酶活單位(U)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每毫升純酶或菌懸液的GAD活力(U/mL)進(jìn)行表示,并以平均活力最高的實(shí)驗(yàn)組酶活力作為100%計(jì)算相對酶活力(%)。

GAD純酶或全細(xì)胞GAD催化生成的GABA的濃度按照式(1)進(jìn)行計(jì)算,單位體積GAD或全細(xì)胞GAD的活力按照式(2)進(jìn)行計(jì)算。

Ci=Ct-C0

式(1)

式(1)中,Ci為實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)終止液中由轉(zhuǎn)化反應(yīng)合成的GABA濃度,mmol/L;Ct為實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)終止液的GABA濃度,mmol/L;C0為對照組反應(yīng)終止液的GABA濃度,mmol/L。

式(2)

式(2)中,Ci為實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)終止液中由轉(zhuǎn)化反應(yīng)合成的GABA濃度,mmol/L;Vi為實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)液的體積,mL;V為實(shí)驗(yàn)組GAD純酶或菌懸液的體積,mL;1000為單位換算系數(shù)。

1.2.6 pH對GAD純酶和全細(xì)胞GAD活性的影響 分別以pH4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8的0.3 mol/LL-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)作為底物,分別按照1.2.5測定GAD純酶和全細(xì)胞GAD的活性。

1.2.7 732陽離子交換樹脂對反應(yīng)體系pH的影響 稱取經(jīng)L-Glu平衡的樹脂10 g,加入0.3 mol/LL-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)10 mL、菌懸液10 mL,混勻,分別于80 r/min、40 ℃水浴振蕩器反應(yīng)0、3、6、9、12、24 h,尼龍濾布過濾,分別收集濾液和樹脂,將濾液立即于4 ℃、8500 r/min離心15 min,收集上清液(記為轉(zhuǎn)化液),并測定轉(zhuǎn)化液的pH;對樹脂進(jìn)行洗脫(記為洗脫液),將洗脫液于4 ℃、8500 r/min離心15 min,去除沉淀。分別測定轉(zhuǎn)化液和樹脂洗脫液的GABA含量。以不加樹脂按同樣操作作為對照組。

1.2.8 GABA對GAD純酶和全細(xì)胞GAD活性的影響 分別以pH4.2的0.25 mol/LL-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)、L-Glu/GABA混合溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液,L-Glu終濃度為0.25 mol/L,GABA終濃度為0.2 mol/L)作為底物,按照1.2.5測定GAD純酶和全細(xì)胞GAD的活性。

1.2.9 全細(xì)胞對GABA的代謝作用 分別取pH分別為4.2、4.6、5.0、5.4、5.8的0.3 mol/L GABA溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)1 mL與菌懸液1 mL混勻,40 ℃水浴反應(yīng)6 h,立即加入-20 ℃冷凍的無水乙醇2 mL,于4 ℃、8500 r/min離心15 min,取上清液測定GABA含量。以121 ℃滅菌20 min的菌懸液1 mL按同樣操作作為對照。通過比較實(shí)驗(yàn)組與對照組中反應(yīng)液GABA濃度的差異評價細(xì)胞對GABA的代謝作用。

1.2.10 GABA對732陽離子交換樹脂結(jié)合的L-Glu的交換能力 分別稱取經(jīng)pH4.2、4.6、5.0和5.4L-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)平衡的樹脂4 g,加入對應(yīng)pH的0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液8 mL,室溫浸泡5 min,洗滌未交換的L-Glu,濾布過濾,將樹脂分別加入對應(yīng)pH的0.2 mol/L GABA溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)8 mL,室溫浸泡30 min,間歇攪拌,濾布過濾,濾液記為交換液;將樹脂分別加入對應(yīng)pH的0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液8 mL,室溫浸泡5 min,洗滌未交換的GABA,濾布過濾,然后對樹脂進(jìn)行洗脫,重復(fù)洗脫2次,合并洗脫液。分別測定交換液L-Glu的含量及洗脫液L-Glu和GABA的含量。

1.2.11L-Glu濃度對GAD純酶和全細(xì)胞GAD活性的影響 分別以pH4.2的4.8、9.6、19.2、25.6、51.2、76.8、89.6、102.4、128 mmol/LL-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)作為底物,按照1.2.5測定GAD純酶的活性;分別以pH4.2的50、100、150、200、250、300 mmol/LL-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)作為底物,按照1.2.5測定全細(xì)胞GAD的活性。

1.2.12 不同平衡方法制備的732陽離子交換樹脂對全細(xì)胞GAD活力的影響 分別取乙酸鹽緩沖液平衡樹脂和L-Glu溶液平衡樹脂各10 g,分別加入pH4.2、0.3 mol/LL-Glu溶液(溶劑為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液)10 mL、菌懸液10 mL,混勻,分別于80 r/min、40 ℃水浴振蕩器反應(yīng)24 h,尼龍濾布過濾,分別收集濾液和樹脂,將濾液立即于4 ℃、8500 r/min離心15 min,收集上清液(記為轉(zhuǎn)化液);對樹脂進(jìn)行洗脫(記為洗脫液),將洗脫液于4 ℃、8500 r/min離心15 min,去除沉淀。分別測定轉(zhuǎn)化液和樹脂洗脫液的GABA含量。以不添加732陽離子交換樹脂按同樣操作作為對照,以對照組GABA產(chǎn)量作為基準(zhǔn)按式(3)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組GABA增產(chǎn)率(%)比較樹脂對全細(xì)胞活力的影響。

式(3)

式(3)中,P1為對照組GABA產(chǎn)量,mmol;P2為實(shí)驗(yàn)組GABA產(chǎn)量,mmol;100為百分比換算系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對GAD純酶和全細(xì)胞GAD活性的影響

從圖1可見,游離GAD純酶的最適反應(yīng)pH為5.0,而全細(xì)胞GAD的最適反應(yīng)pH為4.4,低于純酶的最適反應(yīng)pH,結(jié)果表明全細(xì)胞存在傳質(zhì)障礙,需要細(xì)胞外環(huán)境的pH達(dá)到4.4,才能保證細(xì)胞內(nèi)的pH達(dá)到5.0,即需要一定濃度差以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外H+和堿化因子的交換速度。圖1顯示,當(dāng)pH偏離最適反應(yīng)pH時,GAD純酶和全細(xì)胞GAD的活力均下降較快,由此可見反應(yīng)體系pH是影響GAD活力的重要因素。

圖1 pH對游離GAD純酶和全細(xì)胞GAD反應(yīng)活性的影響Fig.1 Effects of pH value on the GAD activity of free purified enzymes and whole cells

2.2 732陽離子交換樹脂對反應(yīng)體系pH的影響

圖2對全細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化體系的pH和GABA產(chǎn)量進(jìn)行了監(jiān)測,結(jié)果顯示隨著全細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間延長,實(shí)驗(yàn)組和對照組的反應(yīng)體系的pH和GABA產(chǎn)量均呈上升趨勢,但實(shí)驗(yàn)組GABA產(chǎn)量在各時間段均高于對照組,而反應(yīng)體系的pH略低于對照組。

圖2 732陽離子交換樹脂對細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化體系pH的影響Fig.2 Effects of 732 cation-exchange resins on the pH of whole cells’ GAD bio-transformation system

GAD催化L-Glu發(fā)生α-羧基脫羧生成GABA會消耗H+,從而會造成pH升高[16-20]。理論上,實(shí)驗(yàn)組GABA產(chǎn)量高于對照組(圖2),其反應(yīng)體系的堿化作用應(yīng)該會更強(qiáng),反應(yīng)體系的pH升高應(yīng)更明顯,然而實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)體系的pH卻低于對照組,即實(shí)驗(yàn)組pH偏離GAD最適反應(yīng)pH較對照組更小,說明實(shí)驗(yàn)組添加的732陽離子交換樹脂對反應(yīng)體系的pH有較好的穩(wěn)定作用。

圖1已表明GAD的活性對反應(yīng)體系pH敏感,反應(yīng)體系pH越接近最適反應(yīng)pH,GAD活力越高。隨著全細(xì)胞GAD催化反應(yīng)進(jìn)行,體系的pH逐漸提高,將導(dǎo)致GAD活力逐漸降低。因此,細(xì)胞內(nèi)的堿性物質(zhì)能否及時排除,細(xì)胞外的H+能否及時進(jìn)入細(xì)胞,是影響全細(xì)胞GAD活力的關(guān)鍵因素,然而圖1表明細(xì)胞存在傳質(zhì)障礙,細(xì)胞內(nèi)外需要存在一定H+濃度差,才能穩(wěn)定胞內(nèi)pH。732陽離子交換樹脂是強(qiáng)酸型離子交換樹脂,當(dāng)與陽離子發(fā)生離子交換時,會釋放H+,從而增加細(xì)胞外的H+濃度,提高H+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速度,及時中和催化反應(yīng)產(chǎn)生的堿,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)pH,保證細(xì)胞GAD能在相對較適宜的環(huán)境下進(jìn)行催化反應(yīng),從而在表觀上對GAD活力呈現(xiàn)促進(jìn)作用。

2.3 732陽離子交換樹脂對全細(xì)胞GAD產(chǎn)物效應(yīng)的影響

2.3.1 GABA對GAD純酶和全細(xì)胞GAD活性的影響 從圖3可見,當(dāng)L-Glu底物溶液中含200 mmol/L GABA時,全細(xì)胞GAD活力低于不含GABA的實(shí)驗(yàn)組,差異極顯著(p<0.01),說明GABA對全細(xì)胞GAD的轉(zhuǎn)化活性具有抑制作用;然而,GABA對游離GAD純酶的活力卻影響不大,含200 mmol/L GABA的實(shí)驗(yàn)組與不含GABA的實(shí)驗(yàn)組差異不顯著(p>0.05),說明GABA對游離GAD純酶的轉(zhuǎn)化活性不存在抑制作用。

圖3 底物中初始GABA濃度對細(xì)胞GAD和游離GAD純酶活力的影響Fig.3 Effect of initial GABA concentration on the GAD activity of whole cells and free purified enzymes

2.3.2 全細(xì)胞對GABA的代謝作用 為了確定GABA對全細(xì)胞GAD和游離細(xì)胞GAD活力的影響不一致的原因,圖4對全細(xì)胞在轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中是否存在下游酶進(jìn)一步代謝GAD催化反應(yīng)產(chǎn)物GABA的情況進(jìn)行了測定,結(jié)果(圖4)表明,當(dāng)以GABA溶液作為底物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng),在pH4.2～5.8范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)組與對照組的GABA濃度無顯著性差異(p>0.05),說明在全細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中不存在GABA被下游酶代謝的情況。

圖4 pH對細(xì)胞GABA代謝的影響Fig.4 Effect of pH value on the GABA metabolism of whole cells

2.3.3 GABA對732陽離子交換樹脂結(jié)合的L-Glu的交換能力 從表1樹脂洗脫液的GABA總量和交換能力測試結(jié)果可見,在pH4.2～5.4范圍內(nèi),732陽離子交換樹脂對L-Glu和GABA均具有一定交換結(jié)合能力;雖然每克樹脂對GABA交換能力隨pH升高而由(267.26±15.20) μmol下降到(89.25±2.85) μmol,但是樹脂對GABA交換結(jié)合能力在測試pH下均強(qiáng)于L-Glu,GABA可與732陽離子交換樹脂平衡時所交換的L-Glu發(fā)生離子交換而結(jié)合于732陽離子交換樹脂。

表1 GABA對732陽離子交換樹脂吸附的L-Glu交換能力Table 1 Exchange capacity of GABA to L-Glu adsorbed by 732 cation exchange resins

GABA的等電點(diǎn)為pI 7.19[22],在pH4.2～5.4范圍內(nèi)帶正電荷,隨著溶液pH升高,正電荷離子減少,樹脂對GABA交換吸附能力下降,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論相符。L-Glu等電點(diǎn)為pI 3.22,理論上在pH4.2～5.4范圍內(nèi)帶負(fù)電荷,但L-Glu有2個-COOH,γ位的-COOH的電離常數(shù)pKR為4.25,因此在pH4.2～5.4范圍仍存在一定L-Glu陽離子,可與732陽離子交換樹脂發(fā)生弱離子交換,離子交換的同時也促進(jìn)了L-Glu的電離平衡向陽離子一側(cè)移動,導(dǎo)致732陽離子交換樹脂對L-Glu也具有一定離子交換能力,這可能是表1樹脂對L-Glu也存在一定交換吸附能力并隨著環(huán)境pH升高而呈現(xiàn)下降的主要原因。

2.3.4 732陽離子交換樹脂對全細(xì)胞GAD產(chǎn)物效應(yīng)影響的綜合分析 GABA是GAD催化反應(yīng)產(chǎn)物,圖3表明GABA對GAD純酶的表觀活力無抑制作用而對全細(xì)胞GAD的表觀活力卻有抑制作用,可能存在兩方面原因:一是由于細(xì)胞中存在代謝GABA的下游酶,如γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶-琥珀酸半醛脫氫酶偶聯(lián)酶[21],當(dāng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系pH升高至下游GABA代謝酶的反應(yīng)活性范圍,將會導(dǎo)致部分GABA被進(jìn)一步代謝,從而導(dǎo)致GAD表觀活性下降;二是伴隨轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行,細(xì)胞內(nèi)GABA產(chǎn)物濃度不斷增大,因全細(xì)胞存在傳質(zhì)障礙,GABA不能及時排出細(xì)胞外,造成GABA不能及時離開GAD活性中心,減緩L-Glu進(jìn)入GAD活性中心的速度,從而造成反應(yīng)速度下降,GAD活力降低。

然而,圖4表明在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中不存在GABA被下游酶代謝的情況,同時表1表明GABA與732陽離子交換樹脂的離子交換能力較強(qiáng)。因此,GABA抑制全細(xì)胞GAD活性的原因應(yīng)為上述第二種情況。當(dāng)在全細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化反應(yīng)中添加732陽離子交換樹脂時,由于反應(yīng)產(chǎn)物GABA可交換結(jié)合于樹脂,將可降低反應(yīng)液中游離GABA濃度,增大細(xì)胞內(nèi)外GABA濃度差,有利于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物GABA向細(xì)胞外傳遞,進(jìn)而提高GABA離開GAD酶活性中心的速度,促進(jìn)細(xì)胞GAD的表觀活力。由此可見,通過離子交換結(jié)合GABA,減少反應(yīng)液游離GABA濃度,加快細(xì)胞向外運(yùn)出GABA的速度而促進(jìn)細(xì)胞GAD的活力,這是732陽離子交換樹脂促進(jìn)全細(xì)胞活性的另一機(jī)制。

2.4 732陽離子交換樹脂對全細(xì)胞GAD底物效應(yīng)的影響

2.4.1L-Glu濃度對GAD純酶和全細(xì)胞GAD活性的影響 圖5顯示,L-Glu濃度對游離GAD純酶和全細(xì)胞GAD的轉(zhuǎn)化活性影響均較大,隨著L-Glu濃度增大,游離GAD純酶的活性增強(qiáng),當(dāng)L-Glu濃度達(dá)到76.8 mmol/L以上時,游離GAD純酶的轉(zhuǎn)化活力達(dá)到最大值,繼續(xù)增加L-Glu濃度,GAD純酶的活力趨于恒定;全細(xì)胞GAD的轉(zhuǎn)化活性也隨L-Glu濃度增大而增強(qiáng),當(dāng)L-Glu濃度為200 mmol/L以上時,全細(xì)胞GAD的轉(zhuǎn)化活性達(dá)到最大值,繼續(xù)增加L-Glu濃度,GAD純酶的活力趨于恒定。結(jié)果表明,GAD純酶和全細(xì)胞GAD均不受L-Glu抑制,不存在底物抑制效應(yīng)。然而,從圖5可見,GAD純酶活力達(dá)到最大時的L-Glu濃度僅為76.8 mmol/L,而全細(xì)胞GAD需要L-Glu濃度達(dá)到200 mmol/L以上時才能達(dá)到最大活力,說明全細(xì)胞存在傳質(zhì)障礙,需要轉(zhuǎn)化液L-Glu濃度達(dá)到200 mmol/L以上時,才能使細(xì)胞內(nèi)L-Glu濃度達(dá)到76.8 mmol/L以上,從而保證細(xì)胞GAD的酶活性中心的處于底物飽和狀態(tài)而發(fā)揮最大催化活力。

圖5 L-Glu對細(xì)胞GAD和游離GAD純酶活力的影響Fig.5 Effect of L-Glu on the GAD activity of whole cells and free purified enzymes

2.4.2 不同平衡方法制備的732陽離子交換樹脂對全細(xì)胞GAD活力的影響 從圖6可見,僅用乙酸鹽緩沖液平衡的樹脂對全細(xì)胞GAD的轉(zhuǎn)化活性沒有促進(jìn)作用,細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性甚至略有下降,但不顯著(p>0.05),而采用L-Glu溶液平衡的樹脂卻可顯著提高細(xì)胞GAD活力(p<0.05),GABA產(chǎn)量提高了27.27%±3.17%。

圖6 732陽離子交換樹脂的平衡方法對全細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化體系GABA增產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of the balance method of 732 cation-exchange resins on the GABA yield increase rate of whole cells GAD transformation system

732陽離子交換樹脂對L-Glu具有一定離子交換作用(表1),當(dāng)反應(yīng)體系中加入僅用乙酸鹽緩沖液平衡的樹脂時,樹脂會交換吸附L-Glu而造成反應(yīng)液中游離L-Glu濃度降低,而反應(yīng)液L-Glu濃度達(dá)到200 mmol/L以上時,才能保證全細(xì)胞GAD達(dá)到最大酶活性(圖5),因此在反應(yīng)體系加入僅用乙酸鹽緩沖液平衡的樹脂時,將造成全細(xì)胞GAD長時間處于相對較低L-Glu濃度的條件下進(jìn)行反應(yīng),導(dǎo)致全細(xì)胞GAD的表觀活力下降,并且這種影響較大,甚至掩蓋了樹脂穩(wěn)定反應(yīng)體系pH和降低反應(yīng)液游離GABA濃度所產(chǎn)生的促進(jìn)作用;而以L-Glu溶液平衡的樹脂由于已經(jīng)交換吸附L-Glu,當(dāng)反應(yīng)體系中加入該樹脂時,不會再交換吸附反應(yīng)液中的游離L-Glu,伴隨轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行,pH和GABA濃度升高,樹脂原吸附的L-Glu將與GABA發(fā)生離子交換而釋放出來,補(bǔ)充因反應(yīng)而消耗的游離L-Glu,從而在較長時間內(nèi)維持全細(xì)胞GAD處于高L-Glu濃度下進(jìn)行催化反應(yīng),從而促進(jìn)全細(xì)胞GAD表觀活力。

2.4.3 732陽離子交換樹脂對全細(xì)胞GAD底物效應(yīng)影響的綜合分析 雖然全細(xì)胞GAD活力無底物抑制效應(yīng),但存在傳質(zhì)障礙,需要轉(zhuǎn)化液L-Glu濃度達(dá)到200 mmol/L以上時才能達(dá)到全細(xì)胞GAD最大活力(圖5)。由于L-Glu在水中的溶解度較小,25 ℃時的溶解度僅為0.864%[23],在pH4.2、0.2 mol/L 乙酸鹽緩沖液中的溶解度更小,實(shí)驗(yàn)使用的0.3 mol/LL-Glu溶液在40 ℃已基本達(dá)到飽和,較全細(xì)胞GAD最大催化活力所需底物濃度(200 mmol/L)僅高100 mmol/L。隨著全細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行,L-Glu將被大量消耗而濃度降低,當(dāng)L-Glu濃度低于200 mmol/L,全細(xì)胞GAD將因底物濃度不足而活力下降。當(dāng)存在L-Glu溶液平衡的樹脂時,樹脂原吸附的L-Glu在反應(yīng)過程中可與反應(yīng)產(chǎn)物GABA發(fā)生離子交換而釋放出來,補(bǔ)充到反應(yīng)液中,維持反應(yīng)液的游離L-Glu濃度,從而使全細(xì)胞能在較長的時間內(nèi)保持最大活力,即全細(xì)胞GAD表觀活力提高。

由此可見,通過向反應(yīng)體系補(bǔ)充酶反應(yīng)底物而促進(jìn)L-Glu向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送也是732陽離子交換樹脂促進(jìn)全細(xì)胞GAD活力的重要機(jī)制之一。

3 討論與結(jié)論

732陽離子交換樹脂能通過離子交換而給出質(zhì)子或者接受電子對,廣義上可作為固體酸應(yīng)用于酸堿催化反應(yīng)。理論上,如能精密控制反應(yīng)過程產(chǎn)生的堿與732陽離子交換樹脂的H+發(fā)生1∶1交換,則可利用732陽離子交換樹脂精確控制反應(yīng)體系的pH。GAD催化L-Glu脫羧后,反應(yīng)體系的pH會升高,逐漸偏離GAD適宜反應(yīng)pH,從而導(dǎo)致GAD活力下降。研究也證實(shí)732陽離子交換樹脂對控制反應(yīng)液的pH具有很好的效果(圖2)。Dinh等[24]利用Amberlyst 15陽離子交換樹脂對GAD游離酶催化反應(yīng)體系的pH控制效果的也進(jìn)行了探討,結(jié)果表明Amberlyst 15陽離子交換樹脂可通過與反應(yīng)體系的Na+發(fā)生離子交換而釋放H+,從而達(dá)到了控制反應(yīng)體系的pH和減少反應(yīng)體系的游離鹽的目的,GABA產(chǎn)量顯著增加。圖1表明,全細(xì)胞GAD的最適反應(yīng)pH低于游離GAD,說明存在傳質(zhì)障礙,需要細(xì)胞外的反應(yīng)液的pH較GAD最適反應(yīng)pH低0.6,才能保證細(xì)胞內(nèi)的pH達(dá)到GAD的最適反應(yīng)pH,從圖1還可知GAD活力對pH較敏感,GAD活力隨pH的偏離而快速下降,因此及時提高反應(yīng)液H+濃度,穩(wěn)定反應(yīng)體系的pH,對保持GAD活力尤為重要。732陽離子交換樹脂通過離子交換作用,能及時釋放H+和接受可堿化反應(yīng)液的GABA,對反應(yīng)體系pH具有很好的調(diào)節(jié)作用。由此可見,通過離子交換釋放H+和去除游離堿化因子,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH,是陽離子交換樹脂促進(jìn)GAD活力的重要途徑。

表1表明732陽離子交換樹脂可交換結(jié)合GABA,因此可有效降低反應(yīng)液中游離GABA的濃度,加快細(xì)胞內(nèi)的GABA向細(xì)胞外傳遞的速度,降低細(xì)胞內(nèi)GABA濃度,加快GABA離開酶活性中心,從而促進(jìn)細(xì)胞GAD的活力。圖5也表明,由于存在傳質(zhì)障礙,細(xì)胞GAD相對于游離GAD需要更高的L-Glu濃度才能維持較高的活力,表1顯示經(jīng)L-Glu平衡的732陽離子交換樹脂可通過與GABA交換而釋放出L-Glu,補(bǔ)充因反應(yīng)而消耗的底物,延長高濃度底物的時間,加快底物進(jìn)入細(xì)胞的速度,從而促進(jìn)細(xì)胞GAD的表觀活力。因此,通過減小游離GABA濃度和維持L-Glu濃度而加快細(xì)胞傳質(zhì)速度,是732陽離子交換樹脂促進(jìn)細(xì)胞GAD活力的另外兩個方面的作用機(jī)制。由于游離酶不存在細(xì)胞傳質(zhì)障礙,因此這兩方面的機(jī)制體現(xiàn)不顯著。

斯晗[21]研究表明谷氨酸棒桿菌催化GABA分解代謝的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶-琥珀酸半醛脫氫酶偶聯(lián)酶在pH5.0以上時已具有催化活性,當(dāng)pH大于6.0時,酶活性快速升高。然而,圖4顯示在pH4.2～5.8范圍內(nèi),不存在GABA被下游酶代謝的情況,可能測試的pH尚未達(dá)到E.faeciumGDMCC60203代謝GABA的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶或γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶-琥珀酸半醛脫氫酶偶聯(lián)酶的活性依賴的pH?；?32陽離子交換樹脂可交換結(jié)合GABA,減少游離GABA,預(yù)期732陽離子交換樹脂在防止GABA被下游酶代謝方面也將有很好的作用,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜合以上分析可見,732陽離子交換樹脂可以通過離子交換而釋放H+、L-Glu及結(jié)合GABA,調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH,并增加反應(yīng)液中游離底物濃度和降低游離產(chǎn)物濃度,增大細(xì)胞內(nèi)外濃度差,克服細(xì)胞傳質(zhì)障礙,加快細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)運(yùn)送速度,從而提高細(xì)胞GAD的表觀活力。