陳究成，彭 靜，毛海光，郭曉令，潘玉春，徐寧迎*

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

嵊縣花豬產(chǎn)于浙江省紹興市的嵊州、上虞等縣市，2006年列入首批國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄[1]，其具有耐粗飼、早熟、產(chǎn)仔多、母性好、雜交配合力、抗病力強(qiáng)和肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)良特性，是浙江省寶貴的地方豬良種資源。不同品種豬在體型外貌、生長(zhǎng)性能、肉質(zhì)性狀、繁殖性能等方面存在的表型差異是自然選擇與人工選擇對(duì)一些目標(biāo)基因強(qiáng)烈定向選擇的結(jié)果，而選擇信號(hào)是與選擇相對(duì)應(yīng)的基因組信息。隨著第二代測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，測(cè)序成本越來(lái)越低，在全基因組層面上檢測(cè)選擇信號(hào)成為可能，而利用選擇信號(hào)分析來(lái)揭示造成豬性狀表型差異的遺傳機(jī)制的相關(guān)研究已廣泛開(kāi)展。Yang等[2]基于豬60K芯片數(shù)據(jù)，利用REHH方法掃描通城豬及大白豬的基因組，找到了關(guān)于生長(zhǎng)、繁殖及免疫應(yīng)答相關(guān)的候選基因；Ai等[3]利用豬基因組芯片找到了18個(gè)中國(guó)地方豬種的選擇信號(hào)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)中國(guó)地方豬在繁殖、免疫相關(guān)基因上有人工選擇的痕跡；Li等[4]利用全基因組測(cè)序技術(shù)的選擇信號(hào)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了巴克夏豬和藏豬一些經(jīng)濟(jì)性狀和攜氧相關(guān)的基因；Kim等[5]利用XP-EHH方法，找到尤卡坦微型豬在體型上的信號(hào)選擇區(qū)域；Xiao等[6-7]利用GGRS建庫(kù)方法發(fā)現(xiàn)浦東白豬在高繁殖力和抗病力上有選擇信號(hào)檢出。因此，本研究利用群體遺傳分化指數(shù)（FST）和核苷酸多態(tài)性（θπ）方法，通過(guò)對(duì)嵊縣花豬和其他豬種群體間的選擇信號(hào)差異分析，找到嵊縣花豬相比于其他豬種群體的選擇信號(hào)區(qū)域，從而對(duì)嵊縣花豬特性形成原因進(jìn)行研究，為嵊縣花豬的保護(hù)和利用提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及樣品 本研究采用10個(gè)豬種共517頭豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其中浙江省地方豬種包括嘉興黑豬、金華豬、嵊縣花豬、淳安花豬、蘭溪花豬、碧湖豬和岔路黑豬7個(gè)品種共計(jì)390頭，外來(lái)豬種包括長(zhǎng)白、大白、杜洛克3個(gè)品種共計(jì)127頭（表1）。所有樣本均采集耳組織樣，并浸沒(méi)于80%的酒精，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩；蚪MDNA提取自采集的耳組織樣本，質(zhì)控合格后進(jìn)行后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建。

1.2 測(cè)序數(shù)據(jù) 本研究基于簡(jiǎn)化基因組GGRS方法[8]進(jìn)行基因組文庫(kù)構(gòu)建，采用Illumina公司Hiseq2000平臺(tái)測(cè)序，測(cè)序方法為Paired-end。測(cè)序數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳到NCBI的 SRA數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）。SRA號(hào)為SRP067498。

表1 實(shí)驗(yàn)豬群信息

1.3 SNP檢出和基因型填補(bǔ) 本研究采用bwa和samtools軟件進(jìn)行SNP檢出，檢出條件：①每個(gè)SNP 位點(diǎn)最少有30%個(gè)個(gè)體被檢測(cè)判型（當(dāng)1個(gè)位點(diǎn)的分型質(zhì)量值Q＞30時(shí)，該個(gè)體才被認(rèn)為檢測(cè)判型）；②最小等位基因頻率（MAF）大于0.05；③每個(gè)位點(diǎn)的平均測(cè)序深度大于5 X。

1.4 Fst群體遺傳分化是指群體間的等位基因頻率存在明顯差異。FST是檢測(cè)群體遺傳分化程度的重要指標(biāo)之一，其主要反映亞群體間的平均雜合性相較于整個(gè)群體的平均雜合性大小的差異。本研究采用Weir等[9]提出的無(wú)偏估計(jì)FST的方法對(duì)檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算，具體計(jì)算公式：

其中，MSP和MSG分別為檢測(cè)的亞群間和整個(gè)群體內(nèi)的位點(diǎn)的誤差均方，nc是指校正后的群體間的平均樣本數(shù)量，計(jì)算公式：

其中，S是總亞群體數(shù)，ni代表第i個(gè)群體的樣本大小，i=1，2，3，……，S；PAi代表第i個(gè)群體SNP中等位基因A的基因頻率；PA是各群體的PA的加權(quán)平均值。

1.5 θπ一個(gè)不依賴于樣本大小m的DNA多態(tài)性的測(cè)度是2個(gè)序列間每個(gè)位點(diǎn)上核苷酸差異的平均值或是核苷酸多樣性。

其中，q是等位基因的總數(shù)，xi是第i個(gè)等位基因的群體頻率，dij是第i個(gè)和第j個(gè)等位基因間每個(gè)座位的核苷酸差異數(shù)或者代替數(shù)。在一個(gè)隨機(jī)交配的群體中，π代表核苷酸水平上的雜合度，可由下式估算：

其中，m代表所研究的DNA序列的總條數(shù)，dij代表第i條序列和第j條序列的核苷酸差異數(shù)或者代替數(shù)，c代表序列總數(shù)的 [m×(m—1)/2]。

1.6 群體間選擇信號(hào)檢測(cè) 本研究采用FST/θπ的方法對(duì)浙江省地方品種間的選擇信號(hào)進(jìn)行選擇。在基因組上以20 kb為單位，以10 kb為步長(zhǎng)進(jìn)行劃窗，計(jì)算窗口的平均FST/θπ值。一般認(rèn)為，當(dāng)FST值處在前5%以及θπ處在后5%區(qū)域有可能是選擇信號(hào)所在的區(qū)域，公式：

其中，θπA和θπB分別代表A群體和B群體的θπ值。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙江省地方豬SNP檢測(cè)結(jié)果 依據(jù)材料方法部分給出的SNP檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)樣本進(jìn)行了過(guò)濾，共有491個(gè)個(gè)體經(jīng)過(guò)篩選進(jìn)行后續(xù)SNPs分型。在經(jīng)過(guò)填補(bǔ)和質(zhì)控后，共計(jì)得到152 006個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中MAF＜0.05共計(jì)11 048個(gè)，哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)（HWE）＜10-6共有32 355個(gè)。將以上位點(diǎn)過(guò)濾之后，最終得到分型完的SNP標(biāo)記共計(jì)108 603個(gè)。SNP位點(diǎn)在染色體上的分布見(jiàn)圖1。

2.2 SNP 注釋結(jié)果 利用Python腳本，將獲得的SNPs和已經(jīng)下載的豬的基因注釋信息數(shù)據(jù)進(jìn)行映射，得到SNPs在基因組上的區(qū)間分布。根據(jù)基因的不同功能，將基因區(qū)間分為基因間和基因內(nèi)2類，基因內(nèi)按基因的結(jié)構(gòu)區(qū)域分類又包括起始/終止密碼子、外顯子、內(nèi)含子、UTR區(qū)。SNPs映射結(jié)果見(jiàn)表2，SNPs在基因內(nèi)的數(shù)量為34 293個(gè)，占SNPs總數(shù)的31.6%，其中分布在內(nèi)含子上的SNPs有20 158個(gè)，占SNP總數(shù)的18.6%。由表2可知， 絕大多數(shù)SNPs分布在基因間，約占總數(shù)的68.4%，在基因內(nèi)的34 293個(gè)位點(diǎn)中，大多數(shù)分布在內(nèi)含子上，占到基因內(nèi)位點(diǎn)總數(shù)的58.8%，另一部分分布在UTR區(qū)，占33.9%，只有少部分分布在外顯子和起始/終止密碼子上，分別占到7.3%和0.03%。

圖1 SNP位點(diǎn)個(gè)數(shù)在染色體上的分布

2.3 嵊縣花豬與其他群體間選擇信號(hào)分析

圖2 嵊縣花豬與浙江省其他地方豬群體的FST/θπ統(tǒng)計(jì)分布結(jié)果

表2 SNPs在基因區(qū)間上的分布

2.3.2 嵊縣花豬與浙江省地方豬群體間選擇信號(hào)分析由圖2可知，嵊縣花豬與浙江省其他地方品種共檢測(cè)到正向選擇區(qū)域111個(gè)，蘭溪花豬最多，共29個(gè)，嘉興黑豬最少，只有9個(gè)。這些區(qū)域主要分布在2號(hào)染色體和12號(hào)染色體上。

為進(jìn)一步了解這些信號(hào)選擇區(qū)域的功能，對(duì)選擇信號(hào)落入的基因及基因的功能進(jìn)行了分析。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，選擇信號(hào)落入的基因一共有9個(gè)，分別是SYT1、FAM135B、GLIS1、GALNT2、BIN1、LOC100627093、TG、SOX9、CH25H。嵊縣花豬與嘉興黑豬群體比較信號(hào)選擇區(qū)域落入的基因數(shù)最多，有5個(gè)，與金華豬群體比較信號(hào)選擇區(qū)落入的基因數(shù)有2個(gè)，與其他浙江省地方豬群體比較都只有1個(gè)基因落入信號(hào)選擇區(qū)域（表3）。

2.3.2 嵊縣花豬與外來(lái)豬群體間選擇信號(hào)分析 由圖3可知，嵊縣花豬與外來(lái)豬群體共檢測(cè)到正向選擇區(qū)域70個(gè)，杜洛克、大白、長(zhǎng)白分別有28、26和26個(gè)信號(hào)選擇區(qū)域。經(jīng)注釋分析，選擇信號(hào)落入的基因一共有8個(gè)，分別是MGAT5、MAPK4K4、KSR2、RBP5、HDLBP、KCNE2、KIRREL3、BTBD11，這些基因大多與免疫、繁殖以及肉質(zhì)性狀相關(guān)（表4）。

3 討 論

本研究利用FST/θπ法對(duì)嵊縣花豬和浙江省其他地方豬品種以及外來(lái)豬品種進(jìn)行了選擇信號(hào)分析，一共檢測(cè)到179個(gè)選擇信號(hào)區(qū)域，落入選擇信號(hào)區(qū)域的基因一共有17個(gè)。其中，與浙江省其他豬種群體比較，在選擇信號(hào)區(qū)域共落入基因9個(gè)，分別是SYT1、FAM135B、GLIS1、GALNT2、BIN1、LOC100627093、TG、SOX9、CH25H。GLIS1被證實(shí)和卵巢發(fā)育和早期胚胎發(fā)育相關(guān)，是一種在卵細(xì)胞和受精卵一、二細(xì)胞期的高表達(dá)蛋白，在胚胎發(fā)育中起著重要的作用[10-11]。SYT1被認(rèn)為是作為鈣離子在囊泡運(yùn)輸和胞吐的過(guò)程傳感器突觸小泡的膜蛋白，其和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程和皮質(zhì)反應(yīng)的影響[12]。GALNT2基因?qū)儆诙嚯?N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族，其主要功能是參與O-糖基化的第一步反應(yīng)。根據(jù)最新的GWAS研究報(bào)道GALNT2基因單核苷酸多態(tài)性可影響高密度脂蛋白膽固醇及甘油三酯水平，其可能參與脂肪代謝，該基因的突變會(huì)導(dǎo)致膽固醇脂沉積，而且其在卵巢中也有較高的表達(dá)，可能和繁殖力相關(guān)[13]。BIN1基因則和背最長(zhǎng)肌生成相關(guān)，突變也會(huì)導(dǎo)致背最長(zhǎng)肌生成[14]。SOX9基因?qū)儆赟OX家族，在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)育中扮演重要角色，廣泛存在于各種組織，主要在睪丸組織表達(dá)，在下丘腦-垂體-睪丸生殖軸中發(fā)揮重要作用，并與睪丸細(xì)胞的增殖及分化過(guò)程有密切的關(guān)系[15-16]。因此，嵊縣花豬相比與浙江省其他地方豬群體檢測(cè)出的這些選擇信號(hào)區(qū)域可能和脂肪分解，繁殖力以及背最長(zhǎng)肌肉生成相關(guān)。與外來(lái)豬種群體比較在選擇區(qū)域共落入基因8個(gè)，分別是MGAT5、MAPK4K4、KSR2、RBP5、HDLBP、KCNE2、KIRREL3、BTBD11。其中，MAPK4K4被報(bào)道和脂肪生成相關(guān)，KCNE2基因在其他物種的研究中發(fā)現(xiàn)和胃酸的分泌密切相關(guān)，因此可推測(cè)該基因和嵊縣花豬的消化功能有一定關(guān)系[17]。MGAT5基因被發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)，且對(duì)T細(xì)胞的激活以及自身免疫具有一定的調(diào)節(jié)作用[18]。KSR2基因作為MAPK信號(hào)通路的支架蛋白，正向調(diào)節(jié) Ras/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤形成和腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)T細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝并在炎癥中起到保護(hù)作用[19-20]。這暗示嵊縣花豬可能在免疫相關(guān)過(guò)程經(jīng)歷了一定的選擇作用，對(duì)揭示嵊縣花豬免疫性狀的遺傳機(jī)制具有一定意義。這也說(shuō)明相比于外來(lái)豬群體，嵊縣花豬在抗病力強(qiáng)、耐粗飼這些優(yōu)良性狀上經(jīng)歷了較強(qiáng)的人工選擇。

表3 嵊縣花豬與浙江省其他地方豬群體信號(hào)選擇區(qū)域

圖3 嵊縣花豬與外來(lái)豬群體的FST/θπ統(tǒng)計(jì)分布結(jié)果

表4 嵊縣花豬與外來(lái)豬群體信號(hào)選擇區(qū)域

4 結(jié) 論

本研究利用10個(gè)豬種共計(jì)517個(gè)個(gè)體的測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)嵊縣花豬群體選擇信號(hào)進(jìn)行了檢測(cè)分析，檢測(cè)到選擇信號(hào)的區(qū)域共計(jì)179個(gè)，落入這些區(qū)域的候選基因有17個(gè)。結(jié)果表明，相比于浙江省其他地方豬群體，嵊縣花豬在脂肪代謝、高繁殖力等性狀上經(jīng)歷了人工選擇；相比于外來(lái)豬群體，嵊縣花豬在免疫相關(guān)、耐粗飼等性狀經(jīng)歷了人工選擇。