牟蕾 衣靜莉 李星志 王虹 張志 劉愛新

摘要：本研究以黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）和青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）為指示菌，從大豆植物根際土壤中篩選到一株拮抗活性較高的菌株（D-7），經(jīng)RecA基因序列分析，鑒定其為新洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cenocepacia）。經(jīng)PCR檢測(cè)，該菌株不存在毒性基因BCESM（esmR）和cblA。致病性分析發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)苜蓿幼苗和洋蔥沒(méi)有致病性。為了解該菌株的抗菌物質(zhì)合成相關(guān)基因，利用Tn5轉(zhuǎn)座子突變法構(gòu)建菌株D-7的突變體庫(kù)，并篩選獲得10株對(duì)黃瓜枯萎病菌抗菌活性減弱的突變體。對(duì)各突變株插入位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，其中5個(gè)突變株的Tn5轉(zhuǎn)座子插入到同一基因，該基因編碼葡萄糖抑制的分裂蛋白A（Glucose-inhibited division protein A， GidA），其余5株突變體的插入位點(diǎn)分別位于不同的基因上，編碼的蛋白包括糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyl transferase）、Ⅱ型分泌系統(tǒng)蛋白（type Ⅱ secretion system protein）等，表明菌株D-7的抗真菌能力有多個(gè)基因參與。

關(guān)鍵詞：新洋蔥伯克霍爾德氏菌；拮抗活性；突變基因

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）07-0126-07

Abstract A bacteria strain D-7 was isolated from soybean rhizosphere soil and showed high anti-microbial activity to plant pathogenic fungi and bacteria， such as Fusarium oxysporum and Ralstonia solanacearum. The strain was identified to be Burkholderia cenocepacia based on RecA gene sequence and phylogenetic analysis. Specific PCR was constructed to amplify virulence genes， such as BCESM （esmR） and cblA， and the results showed the strain D-7 did not have the two genes. It also had no pathogenicity to alfalfa and onion. In order to understand the genes related to antibacterial substances of the strain D-7， a random mutant library was constructed using Tn5 transposon mutation method， and 10 mutants with reduced antimicrobial activity to Fusarium oxysporum were obtained. By the mutant insertion site analysis， we found that the Tn5 transposon in 5 mutants were inserted into the same gene， which encoded glucose-inhibited division protein A （GidA）， while the insertion sites of the remaining 5 mutants were located on different genes， and the encoded proteins included glycosyl transferase， typeⅡ secretion system protein and so on. It indicated that there were multiple genes involved in the antifungal activity of strain D-7 .

Keywords Burkholderia cenocepacia； Antimicrobial activity； Mutant gene

洋蔥伯克氏菌群（Burkholderia cepacia complex，簡(jiǎn)稱Bcc）在自然環(huán)境中分布十分廣泛，包括水、土壤和植物根際等[1， 2]。Bcc是常見的植物根際促生細(xì)菌，具有生物固氮[3]、生物修復(fù)[4]和植物促生[5]等功能。Bcc對(duì)多種植物真菌病害如腐霉病、立枯病和枯萎病等具有明顯的防治效果[6]。任嘉紅等[7]發(fā)現(xiàn)，拮抗細(xì)菌吡咯伯克霍爾德氏菌（B. pyrrocinia）JK-SH007的抗菌粗蛋白可明顯抑制金黃殼囊孢、擬莖點(diǎn)霉、七葉樹殼梭孢3種楊樹潰瘍病病原真菌的生長(zhǎng)。然而，該屬的部分菌株也是人體的條件致病菌[8，9]，因此生產(chǎn)上直接利用活體菌株存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)，目前對(duì)于洋蔥伯克霍爾德氏菌的研究主要集中在抗菌物質(zhì)的活性成分分析及合成相關(guān)基因上。

RecA基因在Bcc菌株不同基因型以及同一基因型間的相似性極高，不同基因型間相似性達(dá)94%～95%，而在同一基因型中的不同Bcc菌株的相似性則高達(dá)98%～99%，對(duì)長(zhǎng)度為1 041 bp的RecA基因的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增率一直很高，基于RecA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹的聚類分析能夠很好地區(qū)分Bcc菌株的各個(gè)種[10]。

洋蔥伯克霍爾德氏菌致病因子（B. cepacia epidemic strain marker，BCESM）和電纜式菌毛及相關(guān)黏附素（cable pili & adhesion， cblA）是Bcc臨床菌株與人體致病菌相關(guān)的兩個(gè)毒力基因[11，12]，常被作為篩選人體條件致病菌的重要標(biāo)志。BCESM基因中存在一個(gè)834 bp的開放閱讀框，即esmR[13]，是Bcc菌株中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)毒力基因，與Bcc菌株的流行致病有關(guān)，因此該基因被認(rèn)為可以用于初步區(qū)分致病菌株與非致病菌株。cblA基因是另一個(gè)用來(lái)鑒定致病性菌株的毒力基因，該基因存在于大多數(shù)流行致病菌株中，編碼大型電纜式菌毛，促使菌體粘附呼吸器官[14，15]，因此認(rèn)為無(wú)cblA基因的Bcc菌株無(wú)法粘附人體，從而缺乏致病力。

本實(shí)驗(yàn)室前期從大豆根際土壤中分離到一株對(duì)多種植物病原真菌、細(xì)菌和卵菌表現(xiàn)出良好抗菌活性的菌株（D-7），經(jīng)過(guò)RecA基因分析，鑒定其為新洋蔥伯克霍爾德氏菌。為了解該菌株的抗菌合成相關(guān)基因，采用Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)對(duì)菌株D-7進(jìn)行隨機(jī)插入突變，獲得多株對(duì)黃瓜枯萎病菌抗性減弱的突變體并通過(guò)質(zhì)粒拯救技術(shù)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步了解菌株的抗菌物質(zhì)合成相關(guān)基因提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株、質(zhì)粒和試劑盒 本研究所用的菌株、質(zhì)粒與試劑盒及其來(lái)源見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基 植物根際菌株及突變菌株的篩選用NA培養(yǎng)基，電轉(zhuǎn)后恢復(fù)菌株生長(zhǎng)用SOC培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)及抗菌作用分析用PDA培養(yǎng)基，大腸桿菌的培養(yǎng)用LA培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株D-7抑菌活性測(cè)定 菌株D-7在NA培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)2 d，用無(wú)菌水洗滌收集菌體，經(jīng)稀釋制成OD600=1的菌懸液。吸取10 μL菌懸液，接種于PDA固體培養(yǎng)基中央，待菌液充分吸收后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h備用。

對(duì)黃瓜枯萎病菌和青枯勞爾氏菌的抑菌活性測(cè)定采用懸浮液噴霧法：用無(wú)菌水分別將黃瓜枯萎病菌和青枯勞爾氏菌配成106 cfu/mL的孢子懸浮液和菌懸液，用1 mL孢子懸浮液和1 mL菌懸液分別對(duì)上述培養(yǎng)48 h的PDA培養(yǎng)基均勻噴霧處理，繼續(xù)在25℃培養(yǎng)2 d，觀察記錄抑菌圈半徑大小。對(duì)姜莖基腐病菌、禾谷鐮孢菌和立枯絲核菌的抑菌活性測(cè)定采用菌絲塊接種法[16]：將直徑5 mm的菌餅分別移接到上述培養(yǎng)48 h的細(xì)菌菌落兩側(cè)，25℃繼續(xù)培養(yǎng)2～5 d后，觀察記錄抑菌圈半徑大小。每處理重復(fù)3次。

1.2.2 菌株D-7種的鑒定 采用CTAB法提取菌株D-7基因組DNA，利用通用引物RecA1和RecA2[10]（表2）擴(kuò)增RecA序列。

50 μL PCR 擴(kuò)增體系包含：10 μL 10×Primer Star buffer，4 μL dNTP Mixture（2.5 μmol/L），2 μL正向引物（10 μmol/L），2 μL反向引物（10 μmol/L），1 μL Primer Star HS DNA polymerase（5 U/μL），2 μL DNA模板（100 ng/μL），29 μL ddH2O。RecA擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)。

將經(jīng)電泳檢測(cè)片段大小正確的PCR產(chǎn)物送至生工生物公司（上海）測(cè)序，將測(cè)序所得的RecA基因序列在GenBank中進(jìn)行BLASTN比較分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與目的序列相似性較大的菌株的RecA 序列，鑒定各菌株所屬種類；對(duì)其中鑒定為伯克氏菌的菌株用RecA序列進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用 MEGA 6.06 軟件以Neighbor-Joining計(jì)算方式生成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3 菌株毒性基因及對(duì)植物安全性檢測(cè) 由于伯克氏菌的某些菌株是人體條件致病菌，為明確菌株D-7的安全性，從三個(gè)方面對(duì)菌株D-7的毒性進(jìn)行分析。

毒性基因檢測(cè)：用洋蔥伯克氏菌致病因子BCESM的特異性引物BCESM1/BCESM2和cblA毒力基因的特異性檢測(cè)引物cblA1/cblA2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序同1.2.2，擴(kuò)增引物及退火溫度見表2。

菌株D-7對(duì)苜蓿的毒力測(cè)定：苜蓿幼苗常作為生物模型用來(lái)評(píng)估Bcc菌株的毒力，參照Bergmann等[17]方法將苜蓿種子進(jìn)行處理，待2片子葉展開時(shí)，用無(wú)菌針頭刺傷苜蓿幼苗的子葉表面，取培養(yǎng)好的菌懸液10 μL （1×106 cfu/mL）針刺接種于苜蓿幼苗的子葉傷口中，每株幼苗接種一片子葉，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)接種10株幼苗，以同濃度洋蔥伯克氏菌LMG1222菌液處理作為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水處理為陰性對(duì)照。將處理好的苜蓿幼苗置于37℃的光/暗交替（12 h/12 h）的培養(yǎng)箱中，6 d后觀察并記錄發(fā)病情況。

D-7菌株在洋蔥莖上的致病性試驗(yàn)：挑選大小適中、新鮮健康的洋蔥作為供試材料，取5 μL、濃度約為1×107 cfu/mL菌液針刺接種于洋蔥鱗莖，每處理重復(fù)3次，以同濃度洋蔥伯克氏菌LMG1222菌液處理作為陽(yáng)性對(duì)照，以生理鹽水處理為陰性對(duì)照。將處理后的洋蔥鱗莖置于26℃培養(yǎng)箱中。按時(shí)觀察并記錄洋蔥的發(fā)病情況。

1.2.4 菌株突變體的篩選鑒定 參照文獻(xiàn)[18]制備菌株D-7的感受態(tài)細(xì)胞，吸取0.5 μL EZ-Tn5TMTnp TransposomeTM，將其電轉(zhuǎn)至50 μL感受態(tài)細(xì)胞中，加入950 μL SOC，28℃振蕩培養(yǎng)1 h使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)。取培養(yǎng)后的菌液100 μL均勻涂布于含有400 ng/μL硫酸卡那霉素（Kan）的NA平板上，28℃倒置培養(yǎng)至單菌落長(zhǎng)出。

挑取單菌落轉(zhuǎn)移至不含抗生素的PDA平板上，28℃培養(yǎng)2 d，噴施黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液（1×106 cfu/mL），28℃繼續(xù)培養(yǎng)4 d，挑選抑菌能力減弱或缺失的突變體，并保存?zhèn)溆谩?/p>

突變體驗(yàn)證：對(duì)獲得的突變株在28℃、NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，參照CTAB法提取突變體基因組DNA，以引物R6KF1/KanR對(duì)轉(zhuǎn)座子內(nèi)部的特異性序列（EZ-Tn5）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物及其相應(yīng)條件見表2，擴(kuò)增體系及程序同1.2.2。

1.2.5 質(zhì)粒拯救法鑒定側(cè)翼序列 采用CTAB法提取突變體基因組DNA，根據(jù)EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子序列上的多克隆酶切位點(diǎn)（圖1），選擇限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ進(jìn)行酶切。酶切體系包含：突變體基因組DNA 5 μL（100 ng/μL），EcoRⅠ1 μL（20 U/μL），10 × H Buffer 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。將各組分混勻后，37℃恒溫水浴鍋中酶切2 h。

酶切產(chǎn)物純化參照Biomiga PCR產(chǎn)物純化試劑盒（DC3511/DC3514）說(shuō)明進(jìn)行。對(duì)純化的酶切產(chǎn)物進(jìn)行自連接，10 μL連接體系包括：純化酶切產(chǎn)物8 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，10 × T4 DNA Ligase Buffer（350 U/μL）1 μL，將各組分混勻后，16℃恒溫水浴鍋中連接4 h，然后轉(zhuǎn)化至E. coli Transfor Max EC100D pir+，篩選陽(yáng)性克隆，送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株D-7抑菌能力測(cè)定

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株D-7對(duì)多種植物病原真菌、細(xì)菌、卵菌都表現(xiàn)出明顯的拮抗活性（圖2）。對(duì)不同菌株抑菌能力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，菌株D-7對(duì)青枯勞爾氏菌、立枯絲核菌的拮抗效果最好，抑菌圈半徑均大于1.5 cm，對(duì)黃瓜枯萎病菌、禾谷鐮孢菌、姜莖基腐病菌的拮抗活性較差，抑菌半徑小于1.0 cm（圖3）。

2.2 菌株D-7種的鑒定

以菌株D-7基因組DNA為模板，利用通用引物RecA1和RecA2擴(kuò)增RecA基因，得到約1.0 kb左右的產(chǎn)物。利用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件MEGA 6.06對(duì)菌株D-7進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)菌株D-7與B. cenocepacia DQ664181和B. cenocepacia NC_008060.1位于同一個(gè)分支（圖4），表明菌株D-7屬于新洋蔥伯克霍爾德氏菌，菌株D-7 RecA基因在NCBI中的登錄號(hào)為MF964231。

2.3 菌株D-7安全性檢測(cè)

以菌株D-7基因組DNA為模板，利用BCESM和cblA基因特異性檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，在菌株D-7中兩對(duì)引物的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，而洋蔥伯克氏菌LMG1222均出現(xiàn)目的條帶（圖5）。

用菌株D-7的菌懸液處理子葉展開的苜蓿幼苗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌株D-7和生理鹽水處理6 d后，苜蓿幼苗的子葉和幼莖未有明顯變化（圖6a，圖6b），但用洋蔥伯克氏菌LMG1222處理的苜蓿幼苗在接種點(diǎn)附近出現(xiàn)壞死、子葉明顯黃化等現(xiàn)象，部分幼苗還表現(xiàn)根莖變形、扭曲等病理反應(yīng)（圖6c）。

洋蔥伯克氏菌最初分離自腐爛的洋蔥鱗莖，因此對(duì)洋蔥的致病力進(jìn)行了測(cè)定。接種菌液5 d后，接種洋蔥伯克氏菌LMG1222的洋蔥鱗莖在接種點(diǎn)附近出現(xiàn)黃色水漬狀壞死斑，接種7 d后，壞死斑擴(kuò)大，且洋蔥組織變軟、腐爛，散發(fā)難聞氣味；而接種菌株D-7和生理鹽水的洋蔥鱗莖，5 d后僅在接種點(diǎn)處出現(xiàn)透明狀接種斑，且接種7 d后接種斑未見擴(kuò)大，洋蔥組織無(wú)腐爛癥狀（圖7）。以上結(jié)果表明，菌株D-7不是洋蔥的致病菌。

2.4 菌株D-7抑菌能力減弱突變體的篩選鑒定

為分析菌株D-7對(duì)病原真菌的拮抗機(jī)制，以黃瓜枯萎病菌為指示菌，從菌株D-7的Tn5轉(zhuǎn)座子突變體庫(kù)中篩選到10株抑菌能力減弱的突變體，利用質(zhì)粒拯救策略對(duì)突變體進(jìn)行基因定位分析。序列分析結(jié)果表明，在10株抑菌活性減弱的突變體中，有5株突變體的突變位點(diǎn)位于同一個(gè)基因上，并且該基因與新洋蔥伯克霍爾德氏菌HI2424 GidA基因具有較高的同源性，核苷酸序列同源性為97%。其余5個(gè)突變體的突變位點(diǎn)分別位于不同的基因，包括N-乙酰谷氨酸合成酶基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因等，且與新洋蔥伯克霍爾德氏菌HI2424中相關(guān)基因的同源性均大于90%（表3），表明D-7對(duì)黃瓜枯萎病菌的抗菌活性有多個(gè)基因參與。

3 討論與結(jié)論

植物根際微生物群體存在多樣性，它們?cè)谥参锊『Ψ乐?、促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面發(fā)揮了重要作用。Bcc菌群作為其中的重要類群之一，也顯示多種生物功能，包括產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、IAA和鐵載體等[19]。前期，我們從大豆根際土壤中篩選到一株對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌、卵菌都有良好拮抗作用的菌株D-7，基于RecA的序列分析，將其鑒定為新洋蔥伯克霍爾德氏菌。BCESM和cblA是Bcc致病流行菌株中兩個(gè)特定的毒力基因，在非致病流行菌株中很少存在，被稱為流行菌株標(biāo)記。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，菌株D-7不存在毒性基因BCESM和cblA，并且對(duì)洋蔥和苜蓿沒(méi)有致病性。

明確菌株D-7合成的抗菌物質(zhì)及其合成相關(guān)基因，對(duì)研究其抑菌作用機(jī)制并進(jìn)一步開發(fā)新型殺菌劑具有重要意義。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，吡咯伯克霍爾德氏菌Lyc2中基因簇ocf編碼的一種環(huán)狀多肽Occidiofungin對(duì)拮抗多種病原真菌起關(guān)鍵作用。我們從D-7突變體庫(kù)中篩選到10株對(duì)黃瓜枯萎病菌拮抗活性減弱的突變體，序列分析發(fā)現(xiàn)，有5株突變體的突變位點(diǎn)位于GidA基因上，表明該基因?qū)-7的抑菌活性非常重要。其余5株突變體的插入位點(diǎn)位于不同的基因上，包括編碼蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶、II型分泌系統(tǒng)蛋白等基因，有關(guān)這些基因與D-7產(chǎn)生抗菌物質(zhì)之間的關(guān)系、作用特點(diǎn)等，尚需進(jìn)行深入的研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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